Kaftrio is a triple therapy recently approved by the EMA and FDA containing the active principles ivacaftor, tezacaftor, and elexacaftor for the treatment of cystic fibrosis patients aged two years and older that present at least one F508del mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene as cause of the recessive autosomal illness. The high efficacy of the treatment in improving life quality leads CF women patients to be more willing to seek pregnancy, however, informed decisions about breastfeeding while taking the medication are currently difficult to take due to the lack of data about both the amount of drug potentially transferred into breastmilk and the consequential health risks for the breastfed infants. For this reason, this study aimed to develop and optimise an LC-MS/MS method for the detection and quantification in breast milk (BM) of Kaftrio active principles and metabolites (ivacaftor-M1, ivacaftor-M6, tezacaftor-M1 and elexacaftor-M23). Given the extreme complexity and variability of the matrix and the high lipophilicity of the analytes, two protein precipitation (PP) protocols were investigated as sample preparation, with a particular focus on the clean-up step for the removal of lipids which, present at high concentrations in the breast milk, result in being the main cause of sample variability, chromatographic performance loss and MS source soiling. The performance of two filter plates (Multiscreen® 96-Well Plate from Merck and Ostro™ 96-Well Plate from Waters) requiring different precipitating solvents (MeOH and ACN) was compared in terms of recovery efficiency (RE%), matrix effect (ME%), and, with the help of proton (1H) and fluorine (19F) Nuclear Magnetic Resonance (NMR), lipid removal efficacy and analyte loss. The chromatographic separation was performed on a reversed-phase C4 column in gradient elution mode using acetonitrile-0.1% formic acid and water-0.1% formic acid as mobile phase and the quantification carried out using deuterated internal standards and experiments of multiple reaction monitoring (MRM) in positive ionisation mode via a triple quadrupole mass spectrometer. Additionally, the employment of HRMS experiments using an Orbitrap Fusion mass spectrometer permitted a reconstruction of the fragmentation pathways of the product ions used in the MS/MS method. Lastly, method validation following EMA guidelines was attempted for the protocol comprising the Multiscreen® 96-Well Plate and MeOH which was selected as the definite after the filter plates comparison for its better performance in terms of analyte recovery and reproducibility and despite its poorer ability to remove lipids (higher matrix effect). The results obtained from validation showed good method sensitivity (LLOQ 25 ng/mL) and selectivity, as well as a reasonable linear trend over a concentration range of 25 to 225 ng/mL, the absence of carry over and average recovery efficiency for all the analytes between 36%-55%. Further work is however required to improve both method precision and accuracy, and the investigation of possible interferences from co-administrated drugs (antibiotics) must be conducted together with the method application on breast milk samples from CF patients to evaluate the clinical relevance of this work.
Il medicinale Kaftrio è una terapia tripla recentemente approvata dall'EMA e dal FDA contenente i principi attivi ivacaftor, tezacaftor ed elexacaftor per il trattamento dei pazienti affetti da fibrosi cistica (FC) di età pari o superiore a 2 anni che presentano almeno una mutazione F508del nel gene CFTR (regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica) come causa di questa malattia autosomica recessiva. Grazie all'elevata efficacia di questo trattamento nel migliorare la qualità della vita, le donne affette da FC sono attualmente più propense ad intraprendere una gravidanza; tuttavia, prendere decisioni informate sull'allattamento al seno durante l'assunzione del farmaco risulta attualmente complesso a causa della mancanza di dati sia sulla quantità di farmaco potenzialmente trasferita nel latte materno che sui conseguenti possibili rischi per la salute del neonato allattato. Per questo motivo, lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare e ottimizzare un metodo LC-MS/MS per il rilevamento e la quantificazione nel latte materno (BM) dei principi attivi e metaboliti (ivacaftor-M1, ivacaftor-M6, tezacaftor-M1 ed elexacaftor-M23) del farmaco Kaftrio. Data la complessità e l'estrema variabilità della matrice e l'elevata lipofilia degli analiti, due differenti protocolli di precipitazione proteica (PP) sono stati investigati per la preparazione del campione, ponendo in particolare attenzione alla fase di clean-up volta alla rimozione dei lipidi che, presenti in alte concentrazioni nel latte materno, sono spesso la causa dell’elevata variabilità dei risultati e della perdita delle prestazioni mass-cromatografiche. Dunque, due piastre filtranti a 96 pozzetti (Multiscreen® 96-Well Plate prodotta da Merck e Ostro™ 96-Well Plate da Waters) compatibili con due differenti solventi precipitanti (MeOH e ACN) sono state confrontate e le loro prestazione valutate confrontando l'efficienza di recupero (RE%), la riduzione dell'effetto matrice (ME%), l'efficacia nella rimozione dei lipidi e la capacità di minimizzare la perdita degli analiti, impiegando per lo studio di questi ultimi due aspetti la risonanza magnetica nucleare (NMR) 1H e 19F. Per quanto riguarda la separazione cromatografica, questa è stata condotta su una colonna C4 a fase inversa in modalità di eluizione a gradiente utilizzando come fase mobile ACN - 0,1% acido formico e H2O - 0,1% acido formico, mentre la quantificazione degli analiti è stata effettuata tramite l’utilizzo di standard interni deuterati ed esperimenti di massa in modalità MRM (multiple reaction monitoring) e ionizzazione positiva impiegando uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo. L’esecuzione di esperimenti di massa in alta risoluzione (HRMS) mediante l’uso di uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion, inoltre, ha reso possibile ipotizzare i pathway di frammentazione che hanno generato gli ioni prodotto utilizzati nel metodo MRM. Infine, un tentativo di validazione seguendo le linee guida riportate dall’EMA è stato effettuando per il protocollo impiegante la piastra Multiscreen® a 96 pozzetti e metanolo (MeOH). I risultati ottenuti hanno mostrato una buona sensibilità, selettività, un ragionevole andamento lineare delle curve di calibrazione e un'efficienza media di recupero tra il 36% e il 55%. Tuttavia, ulteriori studi cha ambiscano al miglioramento della precisione e accuratezza del metodo e alla sua applicazione a campioni reali di latte materno risultano necessari
SVILUPPO DI UN METODO LC-MS/MS PER LA QUANTIFICAZIONE DI KAFTRIO NEL LATTE MATERNO DI PAZIENTI AFFETTE DA FIBROSI CISTICA
APRILE, RITA
2022/2023
Abstract
Il medicinale Kaftrio è una terapia tripla recentemente approvata dall'EMA e dal FDA contenente i principi attivi ivacaftor, tezacaftor ed elexacaftor per il trattamento dei pazienti affetti da fibrosi cistica (FC) di età pari o superiore a 2 anni che presentano almeno una mutazione F508del nel gene CFTR (regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica) come causa di questa malattia autosomica recessiva. Grazie all'elevata efficacia di questo trattamento nel migliorare la qualità della vita, le donne affette da FC sono attualmente più propense ad intraprendere una gravidanza; tuttavia, prendere decisioni informate sull'allattamento al seno durante l'assunzione del farmaco risulta attualmente complesso a causa della mancanza di dati sia sulla quantità di farmaco potenzialmente trasferita nel latte materno che sui conseguenti possibili rischi per la salute del neonato allattato. Per questo motivo, lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare e ottimizzare un metodo LC-MS/MS per il rilevamento e la quantificazione nel latte materno (BM) dei principi attivi e metaboliti (ivacaftor-M1, ivacaftor-M6, tezacaftor-M1 ed elexacaftor-M23) del farmaco Kaftrio. Data la complessità e l'estrema variabilità della matrice e l'elevata lipofilia degli analiti, due differenti protocolli di precipitazione proteica (PP) sono stati investigati per la preparazione del campione, ponendo in particolare attenzione alla fase di clean-up volta alla rimozione dei lipidi che, presenti in alte concentrazioni nel latte materno, sono spesso la causa dell’elevata variabilità dei risultati e della perdita delle prestazioni mass-cromatografiche. Dunque, due piastre filtranti a 96 pozzetti (Multiscreen® 96-Well Plate prodotta da Merck e Ostro™ 96-Well Plate da Waters) compatibili con due differenti solventi precipitanti (MeOH e ACN) sono state confrontate e le loro prestazione valutate confrontando l'efficienza di recupero (RE%), la riduzione dell'effetto matrice (ME%), l'efficacia nella rimozione dei lipidi e la capacità di minimizzare la perdita degli analiti, impiegando per lo studio di questi ultimi due aspetti la risonanza magnetica nucleare (NMR) 1H e 19F. Per quanto riguarda la separazione cromatografica, questa è stata condotta su una colonna C4 a fase inversa in modalità di eluizione a gradiente utilizzando come fase mobile ACN - 0,1% acido formico e H2O - 0,1% acido formico, mentre la quantificazione degli analiti è stata effettuata tramite l’utilizzo di standard interni deuterati ed esperimenti di massa in modalità MRM (multiple reaction monitoring) e ionizzazione positiva impiegando uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo. L’esecuzione di esperimenti di massa in alta risoluzione (HRMS) mediante l’uso di uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion, inoltre, ha reso possibile ipotizzare i pathway di frammentazione che hanno generato gli ioni prodotto utilizzati nel metodo MRM. Infine, un tentativo di validazione seguendo le linee guida riportate dall’EMA è stato effettuando per il protocollo impiegante la piastra Multiscreen® a 96 pozzetti e metanolo (MeOH). I risultati ottenuti hanno mostrato una buona sensibilità, selettività, un ragionevole andamento lineare delle curve di calibrazione e un'efficienza media di recupero tra il 36% e il 55%. Tuttavia, ulteriori studi cha ambiscano al miglioramento della precisione e accuratezza del metodo e alla sua applicazione a campioni reali di latte materno risultano necessariI documenti in UNITESI sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
https://hdl.handle.net/20.500.14240/146518