Silenziamento genico mediante RNAi in Scaphoideus titanus Ball per la soppressione della trasmissione del fitoplasma della Flavescenza dorata della vite

Scaphoideus titanus, a phloem-feeding leafhopper of Nearctic origin, is the main vector of the phytoplasma of Flavescence dorée, which causes economic damages in European vineyards. The only strategies against FDp nowadays are based on uprooting of infected plants, monitoring of insect vector population and its containment through the uses of insecticides, mainly of chemical origin. Furthermore, these are harmful to human health and are environmentally unsustainable because of their effects on non-target organisms. An effective alternative could be the use of molecular tools as a supplement or substitute for classical chemical control, such as RNA interference-based technologies (RNAi). The application of RNAi against the FD vector can have two different objectives: insect control by causing mortality or reduction/prevention of its ability to transmit the phytoplasma. The work in this thesis fits into the latter perspective and in based on previous studies that have highlighted the interactions between the immunodominant membrane protein (Imp) of the FDp and the "receptor" proteins present in the gut of insect vectors. The present work, through RNAi approaches, aims at elucidating functional role of the identified insect proteins, in relation with phytoplasma infection process within vector body. Previous experiments identified, through a pull-down approach, four S. titanus proteins interacting with FDp Imp. Among them, natterin was considered here in the two isoforms identified: Natterin 167 and Natterin 200. Newly emerged adults of S. titanus were microinjected into the hemocoel cavity via a microinjector, with two different dsRNAs molecules previously in vitro synthesized: dsNatt167, to induce silencing of the natterin gene, and dsGFP, as a control. Injected leafhoppers were allowed to feed on Vitis vinifera plants (cv. Barbera) for 15 days, then isolated for 4 days (sufficient for acquisition) on broad bean plants infected with FDp (strain FD-D), and finally transferred back to healthy grapevines for 7 days, required for acquired pathogen to multiply in the insect body. The infection status of the source plant was previously verified and quantified by qPCR with specific primers for FDp: plants with similar pathogen titer were used, in order to equalize acquisition conditions between treated and control insects. The surviving specimens were collected, quickly frozen in liquid nitrogen and then stored in the freezer at -80°C before RNA extraction. Subsequently, RNA was extracted from each single insect and retro-transcribed to cDNA, for gene expression analysis and quantitative detection of acquired pathogen in Real-Time PCR (qPCR). Natterin 167 gene was significantly silenced in treated insects in comparison with controls, conversely from Natterin 200, that did not show any transcript reduction. To assess the presence and titer of the FD phytoplasma in the insect, a qPCR was then performed on the same samples, analyzing two different phytoplasma genes (16S ribosomal and map, encoding a peptidase), in parallel with the quantification of an endogenous insect gene for data normalization (GAPDH). The pathogen titer measured in dsNatt-treated insects was significantly lower than in dsGFP controls, even if no differences in phytoplasma acquisition frequency was found.

Scaphoideus titanus, una cicalina floemomiza di origine neartica, è il principale vettore del fitoplasma della Flavescenza dorata, una fitopatia che causa numerosi danni economici nei vigneti europei. L’unica strategia di controllo nei confronti di FDp, oggigiorno, è basata sulla rimozione delle piante infette, su attenti monitoraggi dell’insetto vettore e sul suo contenimento mediante l’utilizzo di insetticidi, principalmente di origine chimica, i quali sono dannosi per la salute dell’uomo e poco sostenibili a livello ambientale a causa degli effetti sull’entomofauna utile. Un’alternativa efficace potrebbe essere rappresentata da strumenti di tipo molecolare da utilizzare in maniera integrativa o sostitutiva della classica lotta chimica, come le tecnologie basate sull’RNA interferente (RNAi). L’applicazione di RNAi contro il vettore di FD può avere due differenti obiettivi: combattere l’insetto causando mortalità oppure ridurre o impedire la sua capacità di trasmissione. Il lavoro di questa tesi si inserisce in quest’ultima prospettiva e si basa su una mole di studi precedenti che hanno evidenziato le interazioni tra le proteine della membrana cellulare del fitoplasma della Flavescenza dorata e quelle “recettoriali” presenti a livello intestinale degli insetti vettori di questo agente patogeno, al fine di poter caratterizzare dal punto di vista funzionale, tramite approcci di RNAi, le proteine di insetto identificate. Esperimenti svoltisi in precedenza hanno portato, tramite l’approccio pull-down, alla selezione di quattro proteine di S. titanus che avevano dimostrato di interagire con la proteina immunodominante di membrana (Imp) di FDp. Di queste quattro proteine è stata presa in considerazione la natterina nelle due isoforme identificate: Natterina 167 e Natterina 200. Pertanto, individui adulti e neosfarfallati di S. titanus sono stati microiniettati, direttamente nella cavità emocelica tramite un apposito microiniettore, con due diverse molecole di dsRNAs precedentemente sintetizzate in vitro: dsNatt167, per indurre il silenziamento del gene natterina, e dsGFP, come controllo. Al termine della microiniezione le cicaline sono state inserite in isolatori di plexiglass contenenti una pianta di Vitis vinifera cultivar Barbera (varietà molto appetibile per questi insetti) sana per la loro corretta nutrizione. Trascorsi 15 giorni dalla microiniezione di dsRNAs, gli individui di S. titanus sono stati isolati per 4 giorni (sufficienti all’acquisizione) su piante di fava infetta dal fitoplasma della Flavescenza dorata ceppo D, di cui era stata precedentemente verificata e quantificata la presenza tramite qPCR con primer specifici per il riconoscimento del patogeno, poi nuovamente trasferiti su piante di vite sana per altri 7 giorni necessari per la latenza del patogeno nel corpo dell’insetto. Terminato questo periodo, gli esemplari sopravvissuti sono stati raccolti e rapidamente congelati in azoto liquido per poi essere conservati in congelatore a -80°C in attesa dell’estrazione di RNA. Successivamente, l’RNA è stato estratto, è stata fatta una retrotrascrizione e le dovute analisi per valutare il silenziamento genico e il quantitativo di fitoplasma acquisito dagli insetti. Il silenziamento è avvenuto per solamente una delle due isoforme di Natterina (Natterina 167). Ciò ha portato comunque ad una riduzione del titolo di fitoplasma presente nel corpo dell'insetto vettore.