This thesis project proposes the development and characterization of fluorescent probes for imaging procedures based on targeting FAP (Fibroblast Activation Protein) that can be used for diagnostic purposes. Although various imaging techniques such as ultrasound (UA), computed tomography (CT), X-ray, magnetic resonance imaging (MRI), and positron emission tomography (PET) have made rapid improvements to detect tumors, intraoperative molecular imaging offers a much easier perspective to localize tumors in the context of fluorescence-guided surgery (FGS). Targeted tumor imaging with near-infrared fluorescence (NIRF) is an emerging field of real-time intraoperative imaging based on tumor-targeted NIRF probes. In particular, important parameters such as brightness, target binding, in vivo stability, and pharmacokinetics are often affected by the conjugation of fluorescent compounds to targeting structures. NIRF imaging, with wavelengths ranging from 650 to 900 nm, is particularly useful due to features such as minimal auto-fluorescence and high penetration depth, which allow for increased signal-to-background ratio (SBR). The following thesis project aims to design new fluorescent probes with high sensitivity and binding specificity for fibroblast activation protein (FAP), a pan-cancer biomarker overexpressed in more than 90% of solid tumors, in order to evaluate their diagnostic potential and for intra-operative activities. The probes object of study were developed by conjugating a small FAP protein inhibitory peptide, FAPI-46 (a quinoline-based fibroblast activation protein (FAP)-targeted radiotracer) lacking the DOTA chelator, to the cyanines IRDye800CW-NHS, FNIR-Tag-NHS and s775z-NHS, resulting in the following tracers: FAPI-IRDye800CW, FAPI-FNIR-Tag and FAPI-s775z. The tracers were characterized using UV-Vis spectroscopy and fluorescence in order to compare their optical properties and investigate their potential as NIRF contrast agents; in addition, stability in human serum and photostability were evaluated. Fluorescent dyes used for this purpose were identified by evaluating their optical properties and state of the art. It was chosen to work with cyanine heptamethins such as, IRDye800CW, FNIR-Tag and s775z as these have different structures (IRDye800CW, for example, unlike the other two cyanines does not show a zwitterionic structure) which could affect the in vitro and in vivo performances, with particular attention to biodistribution and possible formation of non-fluorescent aggregates.
In questo lavoro di tesi si propone lo sviluppo e la caratterizzazione di sonde fluorescenti per procedure di imaging basate sul targeting di FAP (Fibroblast Activation Protein) che possano essere utilizzate a scopo diagnostico. Nonostante diverse tecniche di imaging, come gli ultrasuoni (UA), la tomografia computerizzata (TC), i raggi X, la risonanza magnetica (MRI) e la tomografia a emissione di positroni (PET) abbiano apportato rapidi miglioramenti per individuare i tumori, l'imaging molecolare intraoperatorio offre una prospettiva molto più semplice per localizzare i tumori nell’ambito della chirurgia guidata dalla fluorescenza (FGS). L'imaging tumorale mirato con fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF), è un campo emergente dell'imaging intraoperatorio in tempo reale basato su sonde NIRF mirate al tumore. In particolare, parametri importanti come la luminosità, il legame con il bersaglio, la stabilità in vivo e la farmacocinetica sono spesso influenzati dalla coniugazione dei composti fluorescenti a strutture preposte al targeting. L’imaging NIRF, con lunghezze d’onda che vanno dai 650 a 900 nm, risulta particolarmente utile grazie a caratteristiche come l'auto-fluorescenza minima e ad un’elevata profondità di penetrazione, le quali permettono un incremento del rapporto segnale-sfondo (SBR). Il seguente progetto di tesi mira alla progettazione di nuove sonde fluorescenti che abbiano un’elevata sensibilità e specificità di legame per la proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP), sovra-espressa in circa il 90% dei tumori solidi, al fine di valutarne il potenziale diagnostico e per attività intra-operatorie. Le sonde oggetto di studio sono state sviluppate coniugando un piccolo peptide inibitore della proteina FAP, il FAPI-46 (un radiotracciante mirato alla proteina di attivazione dei fibroblasti a base di chinolina (FAP)) privo del chelante DOTA, alle cianine IRDye800CW-NHS, FNIR-Tag-NHS e s775z-NHS, ottenendo i seguenti traccianti: FAPI-IRDye800CW, FAPI-FNIR-Tag e FAPI-s775z. I traccianti sono stati caratterizzati utilizzando la spettroscopia UV-Vis e la fluorescenza al fine di confrontarne le proprietà ottiche e investigarne le potenzialità come agenti di contrasto NIRF; inoltre, è stata valutata la stabilità in siero, la fotostabilità e il binding con l’albumina. I coloranti fluorescenti utilizzati per tale scopo sono stati individuati valutandone le proprietà ottiche e lo stato dell’arte. Si è scelto di lavorare con eptametine cianine quali, l'IRDye800CW, il FNIR-Tag e s775z in quanto queste presentano strutture differenti tra loro (l’IRDye800CW, ad esempio, a differenza delle altre due cianine non mostra una struttura zwitterionica) le quali potrebbero incidere sulle performances in vitro ed in vivo dei tre traccianti, con particolare attenzione alla biodistribuzione e alla possibile formazione di aggregati non fluorescenti.
Sviluppo di una sonda fluorescente per procedure di imaging basate su targeting di FAP
ROBETTI, ANITA
2022/2023
Abstract
In questo lavoro di tesi si propone lo sviluppo e la caratterizzazione di sonde fluorescenti per procedure di imaging basate sul targeting di FAP (Fibroblast Activation Protein) che possano essere utilizzate a scopo diagnostico. Nonostante diverse tecniche di imaging, come gli ultrasuoni (UA), la tomografia computerizzata (TC), i raggi X, la risonanza magnetica (MRI) e la tomografia a emissione di positroni (PET) abbiano apportato rapidi miglioramenti per individuare i tumori, l'imaging molecolare intraoperatorio offre una prospettiva molto più semplice per localizzare i tumori nell’ambito della chirurgia guidata dalla fluorescenza (FGS). L'imaging tumorale mirato con fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF), è un campo emergente dell'imaging intraoperatorio in tempo reale basato su sonde NIRF mirate al tumore. In particolare, parametri importanti come la luminosità, il legame con il bersaglio, la stabilità in vivo e la farmacocinetica sono spesso influenzati dalla coniugazione dei composti fluorescenti a strutture preposte al targeting. L’imaging NIRF, con lunghezze d’onda che vanno dai 650 a 900 nm, risulta particolarmente utile grazie a caratteristiche come l'auto-fluorescenza minima e ad un’elevata profondità di penetrazione, le quali permettono un incremento del rapporto segnale-sfondo (SBR). Il seguente progetto di tesi mira alla progettazione di nuove sonde fluorescenti che abbiano un’elevata sensibilità e specificità di legame per la proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP), sovra-espressa in circa il 90% dei tumori solidi, al fine di valutarne il potenziale diagnostico e per attività intra-operatorie. Le sonde oggetto di studio sono state sviluppate coniugando un piccolo peptide inibitore della proteina FAP, il FAPI-46 (un radiotracciante mirato alla proteina di attivazione dei fibroblasti a base di chinolina (FAP)) privo del chelante DOTA, alle cianine IRDye800CW-NHS, FNIR-Tag-NHS e s775z-NHS, ottenendo i seguenti traccianti: FAPI-IRDye800CW, FAPI-FNIR-Tag e FAPI-s775z. I traccianti sono stati caratterizzati utilizzando la spettroscopia UV-Vis e la fluorescenza al fine di confrontarne le proprietà ottiche e investigarne le potenzialità come agenti di contrasto NIRF; inoltre, è stata valutata la stabilità in siero, la fotostabilità e il binding con l’albumina. I coloranti fluorescenti utilizzati per tale scopo sono stati individuati valutandone le proprietà ottiche e lo stato dell’arte. Si è scelto di lavorare con eptametine cianine quali, l'IRDye800CW, il FNIR-Tag e s775z in quanto queste presentano strutture differenti tra loro (l’IRDye800CW, ad esempio, a differenza delle altre due cianine non mostra una struttura zwitterionica) le quali potrebbero incidere sulle performances in vitro ed in vivo dei tre traccianti, con particolare attenzione alla biodistribuzione e alla possibile formazione di aggregati non fluorescenti.I documenti in UNITESI sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
https://hdl.handle.net/20.500.14240/145817