Caratterizzazione delle comunità microbiche endofitiche in cultivar di vite siciliane coltivate in regime non irriguo

Plant development as well as a variety of physiological processes such as nutrient uptake, production of antimicrobial molecules, are promoted by the activities of endophytic microbial communities. Endophytes are microorganisms that colonize internal plant tissues without causing any disease symptoms to their host, establishing symbiotic relationships of different kinds with the plant. The acquisition of these microorganisms by the host plant is mainly through the roots or wounds, and more rarely through epigeal organs. The relationship between plants and endophytic microorganisms has evolved and consolidated over time and is now considered an evolutionary feature of the plant kingdom to such an extent that in some cases plants require the action of endophytes for their survival. In perennial species such as Vitis vinifera, a crop of economic and cultural importance throughout the Mediterranean basin, the symbiotic relationship lasts over time, contributing to the plant adaptation to the external environment. The beneficial effects exerted by endophytes to the grapevine concern important aspects such as the tolerance to drought and to salinity, as well as an increased tolerance to pathogen attacks, through the production of secondary metabolites or molecules with hormonal or antimicrobial action, and more generally by activating the plant defense responses to biotic and abiotic stresses. Based on this evidence, the isolation and identification of such microorganisms and the study of their effects in planta under certain environmental conditions, could offer new formulations of biological control agents to be used in the field with less environmental impact than the use of agrochemicals alone. The aim of this thesis was to characterize the endophytic microbiota present in Sicilian grapevines maintained under non-irrigated regime during the growing season, to identify microbial communities potentially involved in water stress tolerance. To this aim, two approaches were planned: the main one based on isolation of the culturable fraction, and the second approach aimed at metagenomic analysis. The work was conducted by collecting plant material from June to September at one-month intervals. In each sampling, leaves of three Sicilian grapevine varieties were included: Nero d'Avola, Grillo and Catarratto. To isolate the cultivable fraction of the endophytic microbiota, the leaves were sterilized following a grapevine-specific protocol. Following the sterilization, a part of the leaf samples was used for pure culture isolation of the microorganisms, while another part was stored at -80 C° for DNA extraction for metagenomic analysis. Pure cultures of microbial isolates (bacteria, yeasts and fungi) were subjected to morphological analysis under a microscope, from each of them liquid cultures and glycerol stabs were obtained to be stored at -80 C°. Following the purification of microbial DNA, molecular identification was carried out by PCR amplification and sequencing of the 16S ribosomal operon for bacteria, and of the non-coding region of ribosomal DNA (ITS) for fungi and yeasts. For metagenomic analysis, total DNA was extracted from some leaf samples of Nero d'Avola and Grillo grapevines and stored at - 80 C°, then used as template for the amplification of the V4 region of bacterial 16S ribosomal RNA.

Lo sviluppo della pianta, e svariati processi fisiologici come l’assorbimento dei nutrienti, la produzione di molecole antimicrobiche, sono favoriti dalle attività di comunità microbiche endofitiche. Gli endofiti sono microrganismi che colonizzano i tessuti vegetali interni, senza causare alcun sintomo di malattia nell’ospite e possono instaurare con la pianta delle relazioni simbiotiche di diversa natura. L’ingresso di questi microrganismi avviene principalmente tramite il suolo dalle radici oppure tramite ferite e più raramente attraverso gli organi epigei. La relazione tra pianta e microrganismo si è evoluta e consolidata nel tempo, ed è ritenuta oggi una caratteristica evolutiva del regno vegetale a tal punto che in alcuni casi le piante necessitano dell’azione degli endofiti per la loro sopravvivenza. Nelle specie perenni come Vitis vinifera, coltura di rilevanza economica e culturale in tutto bacino del Mediterraneo, il rapporto simbiotico si mantiene nel tempo e concorre a modulare l’adattamento della pianta all’ambiente esterno. Gli effetti benefici esercitati dagli endofiti sulla vite riguardano aspetti importanti come la tolleranza a stress idrico e salinità e la resistenza all’attacco di diversi patogeni, tramite la produzione di metaboliti secondari o molecole ad azione ormonale, antimicrobica, e più in generale attivando le risposte di difesa della pianta a stress biotici e abiotici. Sulla base di queste evidenze, riuscire a isolare e identificare tali microrganismi, studiandone gli effetti in planta in determinate condizioni ambientali, potrebbe offrire nuove formulazioni di agenti di lotta biologica da utilizzare in campo con un minor impatto ambientale rispetto all’impiego dei soli agrofarmaci. Lo scopo della presente tesi è stata la caratterizzazione del microbiota endofitico presente in viti siciliane mantenute in regime non irriguo nel corso della stagione vegetativa per identificare le comunità microbiche potenzialmente coinvolte nella tolleranza allo stress idrico. A tal fine sono stati previsti due approcci: il principale basato sull’isolamento della frazione coltivabile e un secondo approccio finalizzato all’analisi metagenomica. Il lavoro è stato condotto effettuando i campionamenti da giugno a settembre a distanza di un mese ciascuno. In ogni campionamento sono state raccolte foglie di tre varietà di vite siciliane: Nero d’Avola, Grillo e Catarratto. Per isolare la frazione coltivabile del microbiota endofitico, le foglie sono state sterilizzate seguendo un protocollo specifico per vite. A seguito della sterilizzazione, una parte dei campioni fogliari è stata utilizzata per l’isolamento in coltura pura dei microrganismi, un’altra parte è stata conservata a -80 °C per l’estrazione del DNA destinato all’analisi metagenomica. Le colture pure dei microrganismi isolati (batteri, lieviti e funghi) sono state sottoposte ad analisi morfologica al microscopio, da ciascuna di esse sono state ottenute brodocolture e stab in glicerolo conservati a -80 °C. L’identificazione molecolare è stata condotta previa estrazione del DNA microbico, mediante PCR e sequenziamento del tratto codificante l’operone ribosomiale 16S per i batteri, e della regione non codificante del DNA ribosomiale (ITS) per funghi e lieviti. Ai fini dell’analisi metagenomica, il DNA totale è stato estratto da alcuni campioni fogliari di viti Nero d’Avola e Grillo conservati a - 80 °C e sottoposto ad amplificazione della regione V4 dell’RNA ribosomiale 16S batterico.