Eggplant (S. melongena L.), is a dicotyledonous plant belonging to the Solanaceae family, which includes about 80 genera and 2,700 species adapted to different environments. Given the importance of this crop, there is great interest in the use of the most innovative biotechnological systems, such as CRISPR/Cas9, in order to improve its production yields and safeguard it against various threats, both abiotic in nature but also and especially biotic. Susceptibility genes (S genes) encode for proteins necessary for the pathogen in order to establish a compatible interaction and initiate the infectious process. DMR6-1 belongs to the superfamily of Fe(II)-dependent 2-oxoglutarate dioxygenases (2-ODDs), which are overexpressed during infection by pathogens. Inactivation of this gene leads to increased salicylic acid and confers resistance to several pathogens, including bacteria and oomycetes. In this thesis work, CRISPR/Cas9-mediated knock-out of a susceptibility gene, DOWNY MILDEW RESISTANCE 6-1 (DMR6-1), was induced in the Black Beauty eggplant cultivar with a view to developing pathogen-tolerant lines. A traditional genetic transformation approach based on co-culture with Agrobacterium tumefaciens and in vitro regeneration was used to induce the formation of knock-out mutants. Out of a total of 200 explants transformed with the knock-out construct of DMR6, 4 were successfully regenerated and were then acclimated in soil, for a regeneration rate of 2%; on the other hand, as for nptII/hCas9 transformants (used as control) out of a total of 60 explants, 4 were successfully regenerated, for a total regeneration rate of 6.6%. In order to evaluate the editing efficiency, the samples were sequenced by Sanger method and the chromatograms obtained were analyzed using Tide software: the editing percentage was very low for all T0 lines, with values generally below 10%. In addition, genotyping of 37 plants of the T₁ generation derived from a T₀ plant of eggplant, cv. Black Beauty previously transformed with the DMR6-1 gene knock-out construct, which had been selected on the basis of editing values. Regarding the editing percentage, of the 37 samples analyzed, 10 were the best, with a knock-out score of 90% or more. The average editing percentage was found to be 61.5 percent and was calculated by taking into consideration the knock-out score of all samples analyzed. After the genotyping analyses were finished, 5 of the 37 plants of the T₁ generation were chosen, based on editing efficiency close to 100%, to set up together with three control lines pathogenicity tests with P. infestans, the etiological agent of Downy mildew,, Phenotypic analysis showed a higher average disease index for the controls than for the edited plants, this translates into higher symptom severity. Analysis of the Real time PCR data confirmed the trend shown by the phenotypic analysis: the ratio of the amount of P. infestans DNA to the amount of plant DNA was lower (45 to 86 percent) in the edited plants than in the controls, confirming a greater tolerance of the edited lines to the pathogen attack.
La melanzana (S. melongena L.), è una pianta dicotiledone appartenente alla famiglia delle Solanaceae, la quale comprende circa 80 generi e 2.700 specie adattate a diversi ambienti. Data l’importanza di questa coltura, c’è grande interesse nell’utilizzo dei più innovativi sistemi biotecnologici, come CRISPR/Cas9, al fine di migliorarne le rese produttive e salvaguardarla nei confronti di varie minacce sia di natura abiotica ma anche e soprattutto di natura biotica. I geni di suscettibilità (geni S) codificano per proteine necessarie al patogeno al fine di stabilire un’interazione compatibile e iniziare il processo infettivo. DMR6-1 appartiene alla superfamiglia delle diossigenasi 2-ossoglutarato Fe (II)-dipendenti (2-ODDs), le quali risultano sovra-espresse durante l'infezione da parte di patogeni. L'inattivazione di questo gene porta a un incremento di acido salicilico e conferisce resistenza a diversi patogeni, tra cui batteri e oomiceti. In questo lavoro di tesi, nella cultivar di melanzana Black Beauty, è stato indotto il knock-out mediato da CRISPR/Cas9 di un gene di suscettibilità, DOWNY MILDEW RESISTANCE 6-1 (DMR6-1), nell’ottica dello sviluppo di linee tolleranti a patogeni. È stato utilizzato un approccio di trasformazione genetica tradizionale basato sulla co-coltura con Agrobacterium tumefaciens e sulla rigenerazione in vitro per indurre la formazione di mutanti knock-out. Su un totale di 200 espianti trasformati con il costrutto di knock-out di DMR6, 4 sono stati rigenerati con successo e sono stati quindi acclimatati in terra, per una percentuale di rigenerazione del 2%; per quanto riguarda invece i trasformanti nptII/hCas9 (utilizzato come controllo) su un totale 60 espianti, 4 sono stati rigenerati con successo, per una percentuale totale di rigenerazione del 6,6%. Al fine di valutare l’efficienza di editing i campioni sono stati sequenziati con metodo Sanger e i cromatogrammi ottenuti sono stati analizzati tramite il software Tide: la percentuale di editing è risultata molto bassa per tutte le linee T0, con valori generalmente al di sotto del 10%. In aggiunta è stata eseguita anche la genotipizzazione di 37 piante della generazione T₁ derivante da una pianta T₀ di melanzana, cv. Black Beauty precedentemente trasformata con il costrutto di knock-out del gene DMR6-1, la quale era stata selezionata sulla base dei valori di editing. Per quanto riguarda la percentuale di editing, dei 37 campioni analizzati, 10 sono risultati i migliori, con un knock-out score pari o superiore a 90%. La percentuale di editing media è risultata essere pari a 61,5% ed è stata calcolata prendendo in considerazione il knock-out score di tutti i campioni analizzati. Terminate le analisi di genotipizzazione, 5 delle 37 piante della generazione T₁ sono state scelte, sulla base dell’efficienza di editing prossima al 100%, per allestire insieme a tre linee controllo dei test di patogenicità con P. infestans, agente eziologico della Peronospora., L’analisi fenotipica ha evidenziato per i controlli un disease index medio maggiore rispetto alle piante editate, ciò si traduce in una gravità dei sintomi maggiore. L'analisi dei dati delle Real time PCR ha confermato il trend mostrato dall'analisi fenotipica: il rapporto tra la quantità di DNA di P. infestans e la quantità di DNA della pianta è risultato inferiore (dal 45 all’86%) nelle piante editate rispetto ai controlli, a conferma di una maggiore tolleranza delle linee editate all'attacco del patogeno.
Gene editing in Solanum melongena L.: knock-out del gene DMR6-1 mediante il sistema CRISPR/Cas9
RIZZA, ANASTASIA
2022/2023
Abstract
La melanzana (S. melongena L.), è una pianta dicotiledone appartenente alla famiglia delle Solanaceae, la quale comprende circa 80 generi e 2.700 specie adattate a diversi ambienti. Data l’importanza di questa coltura, c’è grande interesse nell’utilizzo dei più innovativi sistemi biotecnologici, come CRISPR/Cas9, al fine di migliorarne le rese produttive e salvaguardarla nei confronti di varie minacce sia di natura abiotica ma anche e soprattutto di natura biotica. I geni di suscettibilità (geni S) codificano per proteine necessarie al patogeno al fine di stabilire un’interazione compatibile e iniziare il processo infettivo. DMR6-1 appartiene alla superfamiglia delle diossigenasi 2-ossoglutarato Fe (II)-dipendenti (2-ODDs), le quali risultano sovra-espresse durante l'infezione da parte di patogeni. L'inattivazione di questo gene porta a un incremento di acido salicilico e conferisce resistenza a diversi patogeni, tra cui batteri e oomiceti. In questo lavoro di tesi, nella cultivar di melanzana Black Beauty, è stato indotto il knock-out mediato da CRISPR/Cas9 di un gene di suscettibilità, DOWNY MILDEW RESISTANCE 6-1 (DMR6-1), nell’ottica dello sviluppo di linee tolleranti a patogeni. È stato utilizzato un approccio di trasformazione genetica tradizionale basato sulla co-coltura con Agrobacterium tumefaciens e sulla rigenerazione in vitro per indurre la formazione di mutanti knock-out. Su un totale di 200 espianti trasformati con il costrutto di knock-out di DMR6, 4 sono stati rigenerati con successo e sono stati quindi acclimatati in terra, per una percentuale di rigenerazione del 2%; per quanto riguarda invece i trasformanti nptII/hCas9 (utilizzato come controllo) su un totale 60 espianti, 4 sono stati rigenerati con successo, per una percentuale totale di rigenerazione del 6,6%. Al fine di valutare l’efficienza di editing i campioni sono stati sequenziati con metodo Sanger e i cromatogrammi ottenuti sono stati analizzati tramite il software Tide: la percentuale di editing è risultata molto bassa per tutte le linee T0, con valori generalmente al di sotto del 10%. In aggiunta è stata eseguita anche la genotipizzazione di 37 piante della generazione T₁ derivante da una pianta T₀ di melanzana, cv. Black Beauty precedentemente trasformata con il costrutto di knock-out del gene DMR6-1, la quale era stata selezionata sulla base dei valori di editing. Per quanto riguarda la percentuale di editing, dei 37 campioni analizzati, 10 sono risultati i migliori, con un knock-out score pari o superiore a 90%. La percentuale di editing media è risultata essere pari a 61,5% ed è stata calcolata prendendo in considerazione il knock-out score di tutti i campioni analizzati. Terminate le analisi di genotipizzazione, 5 delle 37 piante della generazione T₁ sono state scelte, sulla base dell’efficienza di editing prossima al 100%, per allestire insieme a tre linee controllo dei test di patogenicità con P. infestans, agente eziologico della Peronospora., L’analisi fenotipica ha evidenziato per i controlli un disease index medio maggiore rispetto alle piante editate, ciò si traduce in una gravità dei sintomi maggiore. L'analisi dei dati delle Real time PCR ha confermato il trend mostrato dall'analisi fenotipica: il rapporto tra la quantità di DNA di P. infestans e la quantità di DNA della pianta è risultato inferiore (dal 45 all’86%) nelle piante editate rispetto ai controlli, a conferma di una maggiore tolleranza delle linee editate all'attacco del patogeno.| File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.14240/145316