IDENTIFICAZIONE DI POTENZIALI BERSAGLI MOLECOLARI DELL'INIBITORE SORAFENIB NELL'OSTEOSARCOMA

L'osteosarcoma (OS) è una neoplasia ad alto grado di malignità, diffuso in età pediatrica e giovanile che tende a generare metastasi a livello polmonare. In assenza di trattamento chemioterapico più della metà dei pazienti sviluppa metastasi entro 6 mesi e più dell'80% va incontro a recidiva. Per questa patologia, emerge quindi l'esigenza di acquisire nuove conoscenze sui meccanismi molecolari alla base della trasformazione neoplastica del tessuto osseo in modo da contribuire allo sviluppo di terapie mirate. Recentemente è stato approvato un nuovo farmaco a bersaglio molecolare, il sorafenib (BAY 43-9006), un inibitore multicinasico che agisce su una serie di recettori tirosina cinasi, quali KIT, PDGFR e VEGFR, coinvolti in diversi tumori umani, ed esplica il suo effetto antitumorale agendo sul trasduttore Raf nella sua forma normale e nella forma mutata V600E con conseguente riduzione dei livelli di ERK1/2 fosforilati. Al fine di verificare la presenza dei bersagli molecolari già conosciuti di sorafenib nell'osteosarcoma è stata effettuata un'analisi immunoistochimica dell'espressione delle proteine ERK1/2 in forma fosforilata e della proteina antiapoptotica Mcl-1 su 30 sezioni tumorali di OS. Nell'analisi è stata anche inclusa la proteina ezrin sottoforma di complesso proteico ERM (ezrin, radixin, moesin), connettore tra membrana cellulare e citoscheletro, individuata come una delle maggiori responsabili del comportamento metastatico dell'OS. Il 66.6% dei campioni tumorali mostra aumento dei livelli di fosforilazione di ERK. La valutazione dell'espressione di Mcl-1 nei tessuti tumorali dimostra che l'84% dei casi presenta espressione mitocondriale della proteina. Inoltre il 70% degli osteosarcomi analizzati mostra attivazione del complesso ERM (P-ERM). E' stata condotta un'analisi mutazionale nella casisitica dell'esone 15 di B-Raf e sono state riscontrate 4 mutazioni (13,3%) di cui 3 già note (596delA, G615R, S602Y ) e una mai descritta (H608L). La valutazione dell'efficacia antitumorale di sorafenib in linee di OS dimostra che il farmaco inibisce la proliferazione cellulare in maniera dose e tempo dipendente (IC50 = 5 µM). L'inibizione della proliferazione cellulare si manifesta attraverso un aumento delle cellule nella fase Go/G1 del ciclo e delle cellule in apotosi suggerendo che il sorafenib possa essere citotossico. A conferma di questa ipotesi dati di saggi di apoptosi rivelano che l'inibitore è in grado di indurre morte cellulare programmata in maniera dose dipendente. (44,4% SOR 5 µM vs 6,2% cellule non trattate). La valutazione in western blot di P-ERK, P-ERM e Mcl-1 mette in evidenza una diminuzione tempo e dose dipendente delle proteine in tutte le linee trattate con il sorafenib. Inoltre la diminuzione di Mcl-1, dovuta al trattamento con sorafenib, induce apoptosi e risulta essere specificamente dovuta all'azione del farmaco, in quanto esperimenti di silenziamento di Mcl-1(siRNA) determinano morte cellulare programmata. L'attività antitumorale è stata quindi indagata utilizzando un modello di xenotrapianti di linee di osteosarcoma umano nei topi CB17-SCID. Il farmaco mostra un'attività antiproliferativa dose dipendente anche in vivo e la capacità di formare colonie polmonari viene notevolmente ridotta. Infine l'analisi immunoistochimica sulle sezioni tumorali conferma i dati ottenuti in vitro, in quanto l'espressione/attivazione dei tre bersagli di sorafenib risulta nettamente inferiore nei tumori dei topi trattati.