Caratterizzazione funzionale di un microRNA specifico di vite

Negli ultimi anni, a causa del cambiamento climatico, il problema di adattamento alla siccità della vite ha acquisito rilevante importanza. Il ruolo dei microRNA (miRNA) nell’adattamento delle piante agli stress ambientali è stato dimostrato in numerose prove sperimentali. È stato precedentemente dimostrato che un miRNA specifico della vite, Vvi_miC137-3p, avente come bersaglio il gene della subunità II del fotosistema I (VvPSI), è sovraregolato in caso di siccità e di infezione da agenti patogeni, tuttavia manca ancora la sua caratterizzazione funzionale. Per ottenere prove sperimentali sul ruolo biologico di Vvi_miC137-3p nella vite, è stata condotta un'approfondita caratterizzazione fisiologica e molecolare di piante transgeniche, in cui questo miRNA era stato precedentemente sovraespresso o silenziato mediante la tecnica del “short tandem target mimic”. 16 linee transgeniche di due cultivar di V. vinifera, 'Bragat rosa' (BRA) e 'Chardonnay' (CH), sovraesprimenti (OE) e silenzianti (STTM) Vvi_miC137-3p sono state sottoposte ad una prova di stress idrico (WS) seguito da una fase di recupero (REC), per vedere le differenze nella risposta alla carenza d'acqua rispetto alle piante madre (PM) e al somaclone (ES CTR). La quantificazione tramite qRT-PCR del Vvi_miC137-3p maturo ha confermato l’efficacia delle trasformazioni genetiche mirate a sovraesprimere o silenziare Vvi_miC137-3p. Le linee OE hanno evidenziato quantità più elevate del precursore del miRNA e del miRNA maturo. La tecnica di silenziamento STTM ha sequestrato in media il 74% del miRNA maturo. È stata confermata la sotto-regolazione di VvPSI da parte di Vvi_miC137-3p. L'integrazione dei dati biometrici, ecofisiologici e molecolari ha mostrato un ruolo di questo miRNA nella regolazione della risposta al WS. È stata osservata una risposta cultivar-specifica, poiché le viti STTM di BRA, nonostante un accumulo significativamente maggiore di clorofilla nelle foglie, hanno mostrato una maggiore suscettibilità al WS. In CH il silenziamento di Vvi_miC137-3p sembra alterare il comportamento anisoidrico tipico di questa varietà, poiché è stata riscontrata una ripida diminuzione di conduttanza stomatica (gs) in 3 delle 4 linee STTM CH durante i primi giorni di trattamento WS. Si è inoltre osservato un ritardo in termini di recupero di gs e del tasso di traspirazione fogliare (E) in 7 su 9 linee transgeniche di CH rispetto ai controlli. In WS severo la maggior parte delle linee transgeniche hanno avuto valori anomali di Ci, tali da superare la CO2 atmosferica, che indica un’alterazione del processo fotosintetico. Le analisi dell’efficienza fotochimica potenziale del fotosistema II (PSII, Fv/Fm), del non-photochemical quenching della clorofilla (NPQ) e della resa quantica del PSII (ΦPSII) non hanno mostrato differenze tra le linee. L’insieme dei parametri morfo-biometrici (altezza e diametro del fusto, angolo e spessore fogliare) ha confermato l'uniformità delle condizioni di crescita. Si può concludere che il metabolismo coinvolto nella fase oscura della fotosintesi fosse compromesso nelle linee transgeniche in condizioni di grave limitazione idrica, e che l'attività dell’enzima Rubisco fosse deviata verso il processo di fotorespirazione. La relazione di causa-effetto tra chiusura stomatica e compromissione metabolica dell'apparato fotosintetico richiede ulteriori indagini a partire da un confronto del contenuto di acido abscissico nelle radici delle linee OE, STTM e i controlli.

In recent years, due to the worsening of climate change effects, grapevine adaptation to drought has gained particular importance. The role of microRNAs (miRNAs) in plant adaptation to environmental stresses was shown in numerous studies. A grapevine-specific miRNA, named Vvi_miC137-3p and targeting the photosystem I subunit II (VvPSI), was previously seen to be up-regulated upon drought and pathogen infection. Nonetheless, the functional characterization of Vvi_miC137-3p is still missing. To gain experimental evidence on the Vvi_miC137-3p biological role in grapevine, an in-depth physiological and molecular characterization of transgenic plants, in which this miRNA had been previously overexpressed or silenced by the short tandem target mimic approach, was conducted. Sixteen transgenic lines of two V. vinifera cultivars, ‘Bragat rosa’ (BRA) and ‘Chardonnay’ (CH), overexpressing (OE) and silencing (STTM) Vvi_miC137-3p were exposed to a water stress (WS) treatment followed by a recovery phase (REC) to inspect differences in their response to water deprivation in comparison with related wild type mother plant (PM) and somaclonal control (ES CTR). The qRT-PCR quantification of the mature Vvi_miC137-3p confirmed the success of the previously conducted genetic transformation experiments aimed at either overexpressing or silencing Vvi_miC137-3p. OE lines showed higher amounts of the miRNA precursor and higher levels of the mature miRNA. On the other hand, the STTM silencing technique reduced the mature miRNA expression by 74% on average. Finally, the Vvi_miC137-3p-mediated downregulation of VvPSI was confirmed, as the gene transcript amounts decreased by about 50% in OE lines, while they increased by about 50% in STTM lines. The integration of biometric, ecophysiological, and molecular data indicated a role for this miRNA in the regulation of the reaction to drought stress. A cultivar-specific response was observed, as BRA STTM vines, despite a significantly higher accumulation of chlorophyll in leaves, showed higher susceptibility to water stress. In CH, Vvi_miC137-3p silencing seemed to alter the anisohydric behavior typical of this variety, as a steep decrease in stomatal conductance (gs) was observed in 3 out of 4 STTM CH lines during the first days of WS imposition. Additionally, post-rehydration recovery was delayed in terms of gs and leaf transpiration rate (E) in 7 out of 9 transgenic CH lines compared to controls. Abnormally high values of Ci, prevailing atmosphere CO2 concentration, at WS in most transgenic lines, prompted us to assume a photosynthetic impairment. Analysis of maximum quantum efficiency of photosystem II (PSII), non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence at midday (NPQ), and quantum yield of photosystem II (ΦPSII) showed no differences among OE, STTM, PM, and ES CTR lines. In addition, a set of morpho-biometric parameters including plant height, stem diameter, leaf angle, and leaf thickness confirmed the uniformity of plant growth conditions during the experiment. It can be concluded that rather the metabolism involved in the dark phase of photosynthesis was compromised in transgenic lines in WS, perhaps switching the Rubisco activity towards photorespiration reactions. The cause-and-effect relationship between stomata closure and metabolic impairment of the photosynthetic machinery needs further research starting with a comparison of abscisic acid in the roots of OE, STTM, PM, and ES CTR.