The following thesis work was carried out at the Residue Research Laboratory of the Experimental Zooprophylactic Institute of Piedmont, Liguria and Valle d'Aosta. The aim of this project was the development and validation of a quantitative LC-MS / MS analytical method for the detection of Bacillus cereus emetic toxin in food. The main etiological agents of food poisoning include the emetic exotoxin produced by some strains of B. cereus (cereulide). The bacterium releases these substances into the food and the onset of symptoms occurs within a few hours after taking the contaminated meal. The production of this toxin occurs only under certain conditions of pH and temperature and a high starch content is required, so the target foods are rice, pasta and potato preparations (Jääskeläinen et al. 2004). The toxin, of a protein nature, is resistant to temperatures over 150 ° C, to a very acid pH and to proteases, so it is not inactivated during the passage in the gastrointestinal tract (Ehling-Schulz et al. 2004, Ceuppens et al. 2011) . The lowest dose of cereulide capable of inducing symptoms found so far is about 8 µg / kg (Pananen et al. 2002, Naranjo et al. 2011). The analytical approach to the problem must take into account that there is no one-to-one correspondence between the presence of the bacterium and the toxin; in fact not all strains of a species are toxigenic and, on the other hand, the toxin can still be present in the food when the bacterium is no longer detected. The laboratories that carry out official analyzes for the research of the causes of food poisoning, from the sporadic event to the extended phenomenon with the involvement of many consumers (school canteens, hospitals, etc.), to manage the criminal implications and the responsibilities of the food sector operator (OSA), they need to have objective evidence that the toxin was present in the food, that is, to find the weapon that caused the emetic syndrome in the patient. In January 2017, the official ISO 18465 method was published, which however only provides general indications on the procedure to follow. The Research Residues laboratory therefore had to optimize both the sample preparation phase, to make it applicable to a wide range of foods beyond those included in the Standard, and the analytical phase. Following ISO 17025 validation and accreditation, the method was used for official controls in suspected foodborne disease (STD) cases.
Il seguente lavoro di tesi è stato svolto presso il laboratorio Ricerca Residui dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta. Scopo di questo progetto è stato lo sviluppo e validazione di un metodo analitico quantitativo LC-MS/MS per la ricerca di tossina emetica del Bacillus cereus in alimenti. Tra i principali agenti eziologici di intossicazioni alimentari si annoverano la esotossina emetica prodotta da alcuni ceppi di B. cereus (cereulide). Il batterio rilascia queste sostanze nell’alimento e l’insorgenza dei sintomi si ha entro qualche ora dopo l’assunzione del pasto contaminato. La produzione di tale tossina avviene solo in determinate condizioni di pH e temperatura ed è richiesto elevato contenuto di amido, per cui gli alimenti target sono rappresentati dalle preparazioni a base di riso, pasta e patate (Jääskeläinen et al. 2004). La tossina, di natura proteica, risulta resistente a temperature oltre 150°C, a pH molto acido e alle proteasi, per cui non è inattivata durante il passaggio nel tratto gastrointestinale (Ehling-Schulz et al. 2004, Ceuppens et al. 2011). La dose più bassa di cereulide capace di indurre i sintomi finora riscontrata è di circa 8 µg/kg (Pananen et al. 2002, Naranjo et al. 2011). L'approccio analitico al problema deve tener conto che non esiste corrispondenza biunivoca tra presenza del batterio e della tossina; infatti non tutti i ceppi di una specie sono tossigeni e, d'altro canto, la tossina può esser ancora presente nell' alimento quando il batterio non è più rilevato. I laboratori che eseguono analisi ufficiali per la ricerca delle cause di intossicazione alimentare, dall’evento sporadico al fenomeno esteso con coinvolgimento di molti consumatori (mense scolastiche, ospedali, ecc), per gestire le implicazioni penali e le responsabilità dell’operatore del settore alimentare (OSA), hanno esigenza di avere evidenza oggettiva che nell’alimento era presente la tossina, cioè trovare l’arma che ha causato la sindrome emetica nel paziente. A gennaio 2017 è stato pubblicato il metodo ufficiale ISO 18465, che però fornisce solo indicazioni di massima sulla procedura da seguire. Il laboratorio Ricerca Residui ha dovuto quindi ottimizzare sia la fase di preparazione del campione, per renderlo applicabile a una ampia gamma di alimenti oltre quelli inclusi nella Norma, che la fase analitica. A seguito di validazione e accreditamento ISO 17025, il metodo è stato utilizzato per controlli ufficiali in casi sospetti di malattia trasmessa da alimenti (MTA).
Dai batteri killer all’arma delle intossicazioni alimentari: nuovi approcci analitici per la rilevazione della tossina emetica cereulide mediante LC-MS/MS
MARTURELLA, MARIANNA
2020/2021
Abstract
Il seguente lavoro di tesi è stato svolto presso il laboratorio Ricerca Residui dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta. Scopo di questo progetto è stato lo sviluppo e validazione di un metodo analitico quantitativo LC-MS/MS per la ricerca di tossina emetica del Bacillus cereus in alimenti. Tra i principali agenti eziologici di intossicazioni alimentari si annoverano la esotossina emetica prodotta da alcuni ceppi di B. cereus (cereulide). Il batterio rilascia queste sostanze nell’alimento e l’insorgenza dei sintomi si ha entro qualche ora dopo l’assunzione del pasto contaminato. La produzione di tale tossina avviene solo in determinate condizioni di pH e temperatura ed è richiesto elevato contenuto di amido, per cui gli alimenti target sono rappresentati dalle preparazioni a base di riso, pasta e patate (Jääskeläinen et al. 2004). La tossina, di natura proteica, risulta resistente a temperature oltre 150°C, a pH molto acido e alle proteasi, per cui non è inattivata durante il passaggio nel tratto gastrointestinale (Ehling-Schulz et al. 2004, Ceuppens et al. 2011). La dose più bassa di cereulide capace di indurre i sintomi finora riscontrata è di circa 8 µg/kg (Pananen et al. 2002, Naranjo et al. 2011). L'approccio analitico al problema deve tener conto che non esiste corrispondenza biunivoca tra presenza del batterio e della tossina; infatti non tutti i ceppi di una specie sono tossigeni e, d'altro canto, la tossina può esser ancora presente nell' alimento quando il batterio non è più rilevato. I laboratori che eseguono analisi ufficiali per la ricerca delle cause di intossicazione alimentare, dall’evento sporadico al fenomeno esteso con coinvolgimento di molti consumatori (mense scolastiche, ospedali, ecc), per gestire le implicazioni penali e le responsabilità dell’operatore del settore alimentare (OSA), hanno esigenza di avere evidenza oggettiva che nell’alimento era presente la tossina, cioè trovare l’arma che ha causato la sindrome emetica nel paziente. A gennaio 2017 è stato pubblicato il metodo ufficiale ISO 18465, che però fornisce solo indicazioni di massima sulla procedura da seguire. Il laboratorio Ricerca Residui ha dovuto quindi ottimizzare sia la fase di preparazione del campione, per renderlo applicabile a una ampia gamma di alimenti oltre quelli inclusi nella Norma, che la fase analitica. A seguito di validazione e accreditamento ISO 17025, il metodo è stato utilizzato per controlli ufficiali in casi sospetti di malattia trasmessa da alimenti (MTA).| File | Dimensione | Formato | |
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