Metodi di risonanza di spin elettronico (EPR) per la caratterizzazione di metalloenzimi a base di rame

Copper is an element that has an important role in biology, in particular as a co-factor in many metalloenzymes that regulate the processes of homeostasis, electronic transport, transport and activation of oxygen. In these reactions the oxidation states of Cu oscillate between the +2 - paramagnetic (S = 1/2) - and + 1 (S = 0) state with a plurality of coordinative neighborhoods that largely determine the functions of Cu. Copper-containing proteins can be divided into four main categories, based on the coordination and number of Cu ions involved. The copper in these systems is typically coordinated to ligands containing N and/or S and can exhibit tetrahedral, square planar, or pyramidal coordination. There are also proteins characterized by bimetallic centers in close proximity and systems characterized by the presence of small clusters. This variety of structural motifs is reflected in the variety of catalytic functions performed in the different metalloenzymes. In the last twenty years, it has been discovered that copper-based enzymes are capable of breaking the glycosidic bond of recalcitrant carbohydrates - so are defined carbohydrates whose bond requires a lot of energy to be broken (about 95 kcal / mol) - such as cellulose, starch, lignocellulosic biomass, chitin and xylones. These enzymes are called LPMOs (Lytic Polysaccharides Monooxygenases) and are gaining increasing attention, which has mainly focused on their use in enzymatic “cocktails” for the production of second generation biofuels. They find their use in activities dedicated to the production of biofuels, such as bioethanol, or to the conversion of chitin into high-value biomaterials. The catalytically active center of these enzymes consists of a single copper ion whose oxidation state oscillates between +2 and +1. The presence of copper in the oxidation state +2 (paramagnetic copper) allows the use of EPR (Electron Paramagnetic Resonance) spectroscopy; a particularly efficient spectroscopic method to study the behavior of paramagnetic copper allowing to describe selectively its geometric and electronic structure as well as its dynamics. In this thesis various aspects of EPR spectroscopy applied to the study of copper-based enzymes with particular attention to LPMO have been investigated by deepening the correlation between structural aspects and their unusual catalytic properties with reference to the active sites of Cu in biological systems.

Il rame è un elemento che gioca un ruolo importante in biologia, in particolare come co-fattore in molti metalloenzimi che regolano processi di omeostasi, trasporto elettronico, trasporto e attivazione dell’ossigeno. In queste reazioni gli stati di ossidazione del Cu oscillano tra lo stato +2 – paramagnetico (S = 1/2) – e + 1 (S = 0) con una pluralità di intorni coordinativi che in larga misura determinano le funzioni del Cu. Le proteine contenenti rame si possono suddividere in quattro grandi categorie, sulla base della coordinazione e del numero di ioni Cu coinvolti. Il rame in questi sistemi è tipicamente coordinato a leganti contenenti N e/o S e può esibire coordinazione tetraedrica, planare quadrata o piramidale. Esistono poi proteine caratterizzate da centri bimetallici in stretta prossimità e sistemi caratterizzati dalla presenza di piccoli clusters. Questa varietà di motivi strutturali si riflette sulla varietà di funzioni catalitiche espletate nei diversi metalloenzimi. Negli ultimi vent’anni sono stati scoperti enzimi a base di rame in grado di rompere il legame glicosidico di carboidrati recalcitranti – sono così definiti i carboidrati il cui legame richiede molta energia per essere rotto (circa 95 kcal/mol) – come la cellulosa, l’amido, la biomassa lignocellulosica, la chitina e gli xiloni. Questi enzimi vengono chiamati LPMO (Lytic Polysaccharides Monooxygenases) e stanno conquistando un'attenzione sempre maggiore, che si è concentrata principalmente sul loro uso in “cocktail” enzimatici per la produzione di biocarburanti di seconda generazione. Trovano il loro utilizzo in attività dedicate alla produzione di biocombustibili, come il bioetanolo, oppure alla conversione della chitina in biomateriali di alto valore. Il centro cataliticamente attivo di questi enzimi è costituito da un singolo ione rame il cui stato di ossidazione oscilla tra +2 e +1. La presenza del rame nello stato di ossidazione +2 (rame paramagnetico) consente di utilizzare la spettroscopia EPR (Electron Paramagnetic Resonance); un metodo spettroscopico particolarmente efficiente per studiare il comportamento del rame paramagnetico permettendo di descriverne in modo selettivo la struttura geometrica ed elettronica nonché le dinamiche. In questa tesi sono stati approfonditi diversi aspetti della spettroscopia EPR applicati allo studio di enzimi a base di rame con particolare attenzione alle LPMO approfondendo la correlazione tra aspetti strutturali e le loro insolite proprietà catalitiche con riferimento ai siti attivi di Cu nei sistemi biologici.