The grapevine Ampelovirus leaf roll associated virus 1 and 3 (GLRaV-1 and GLRaV-3) and Vitivirus grapevine virus A (GVA) are widely used in vineyards around the world and causing damage to production mainly qualitative but also quantitative. Their incidence and harmfulness is highly variable depending on the different cultivars, but some studies have estimated damages up to 30-40% in some situations with high incidence and high varietal susceptibility. The epidemiology of the virus associated with complex leaf roll virus infection and wood curly vine is still little known and to date some insect vectors have been identified, all belonging to the superfamily Coccoidea, Pseudococcidae and Coccidae family. Scale insects are characterized by the vector floemomiza nutrition and limited mobility. The species of the family Pseudococcidae still show a higher mobility than other scale insects and therefore are considered the most important carriers. So far, the specific composition of Pseudococcidofauna vineyards in northeastern Italy was totally unknown. Similarly the incidence of the viral infection in natural populations of Pseudococcidi in the vineyard was unknown. Although for the vector species it was reported the transmission capacity of more viruses, the quality of the viral infection of scale insects in nature it was also unknown. The aims of the research were: - complete a key molecular identification, rapid and applicable to all life stages and species of vine pseudococcidi; - census of species pseudococcidi carriers present in the vineyards of north-west develop a sensitive and specific molecular detection in real-time PCR for detection of viruses associated with leaf roll and wood hedgehogs in individuals of insect vectors; - investigate the infectivity of natural populations of pseudococcidi in vineyards of north-west; - develop a system for quantification of viruses in insect vectors that allow to study virus-vector relationships under controlled experimental conditions. The first objective was pursued drawing and experimenting with a species-specific primers for Heliococcus bohemicus that was added to the cocktail of specific primers for Planococcus ficus, Pl citri. The second and fourth objective were pursued by reliefs in the vineyards of Piedmont and Liguria, subsequent morphological and molecular identification of species and diagnosis of GLRaV-1, GLRaV-3 and GVA in groups or in individual young people and adults of vector species. Piedmont was present only in H. bohemicus, always at very low population levels. In Liguria we found H. bohemicus, ficus Pl and Ps. longispinus, often in mixed infections with higher population levels. Pl citri has not been found in the vineyards of Piedmont and Liguria. For detection of virus in individuals of carriers it has been developed a diagnosis in real time PCR based amplification of a short sequence of coat protein with virus-specific primers and SybrGreen, followed by analysis of melting curve. Finally, the development of a system for quantification of virus GLRaV-1, GLRaV-3 and GVA in pseudococcidi carriers were studied three "housekeeping gene" that has analyzed the stability of expression in different life stages of Pl citri and ficus Pl. The gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase was chosen as the best housekeeping gene for use as a reference in quantitative real time PCR assays for describing changes in viral titer in the insect vectors.
Gli Ampelovirus grapevine leaf roll associated virus 1 e 3 (GLRaV-1 e GLRaV-3) e il Vitivirus grapevine virus A (GVA) sono largamente diffusi nei vigneti di tutto il mondo e causano danni alla produzione principalmente qualitativi e secondariamente quantitativi. La loro incidenza e dannosità, è molto variabile in funzione delle diverse cultivar, ma alcuni studi hanno stimato danni fino al 30-40% in alcune situazioni con elevata incidenza ed elevata suscettibilità varietale (Golino et al., 2002). L'epidemiologia dei virus associati al complesso del leaf roll virosico e del legno riccio della vite è ancora poco conosciuta, ad oggi sono stati identificati alcuni insetti vettori, tutti appartenenti alla superfamiglia Coccoidea, famiglie Pseudococcidae e Coccidae ed è stata proposta per la trasmissione una modalità di tipo semipersistente. Le cocciniglie vettrici sono caratterizzate da nutrizione floemomiza e limitata mobilità. Le specie della famiglia Pseudococcidae manifestano comunque una mobilità maggiore rispetto alle altre cocciniglie e per questo sono considerate i vettori più importanti. Sino ad ora la composizione specifica della Pseudococcidofauna dei vigneti dell'Italia Nord-Occidentale era totalmente sconosciuta e si presumeva essere simile a quella di altri areali italiani indagati. Similmente l'incidenza dell'infezione virale nelle popolazioni naturali di Pseudococcidi in vigneto era sconosciuta. Sebbene per le specie vettrici sia stata segnalata la capacità di trasmissione di più virus, la qualità dell'infezione virale delle cocciniglie in natura, singola o mista, era altrettanto sconosciuta. Infine le informazioni sulle relazioni virus-vettore si limitano alla conoscenza su una persistenza limitata a 2-3 giorni dell'infettività del vettore. Gli scopi della ricerca sono stati: ¿ completare una chiave di identificazione molecolare, rapida e applicabile su tutti gli stadi vitali, delle specie di pseudococcidi della vite ¿ censire le specie di pseudococcidi vettori presenti nei vigneti dell'Italia Nord-Occidentale ¿ mettere a punto una diagnosi molecolare sensibile e specifica in real time PCR per il rilevamento dei virus associati al leaf roll e al legno riccio in singoli individui degli insetti vettori ¿ indagare l'infettività delle popolazioni naturali degli pseudococcidi nei vigneti dell'Italia Nord-Occidentale ¿ mettere a punto un sistema di quantificazione dei virus negli insetti vettori che permetta di studiare le relazioni virus-vettore in condizioni sperimentali controllate Infine, per la messa a punto di un sistema di quantificazione dei virus GLRaV-1, GLRaV-3 e GVA negli pseudococcidi vettori sono stati studiati tre ¿housekeeping gene¿ di cui è stata analizzata la stabilità di espressione in diversi stadi vitali di Pl. citri e Pl. ficus. Il gene gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi è stato scelto come miglior gene housekeeping da utilizzare come riferimento quantitativo nei saggi di real time PCR per descrivere l'andamento del titolo virale negli insetti vettori.
Pseudococcidi vettori di Ampelovirus e Vitivirus: identificazione molecolare delle specie e dei virus associati in vigneti dell'Italia Nord-Occidentale
GRAZIANO, CARLO
2008/2009
Abstract
Gli Ampelovirus grapevine leaf roll associated virus 1 e 3 (GLRaV-1 e GLRaV-3) e il Vitivirus grapevine virus A (GVA) sono largamente diffusi nei vigneti di tutto il mondo e causano danni alla produzione principalmente qualitativi e secondariamente quantitativi. La loro incidenza e dannosità, è molto variabile in funzione delle diverse cultivar, ma alcuni studi hanno stimato danni fino al 30-40% in alcune situazioni con elevata incidenza ed elevata suscettibilità varietale (Golino et al., 2002). L'epidemiologia dei virus associati al complesso del leaf roll virosico e del legno riccio della vite è ancora poco conosciuta, ad oggi sono stati identificati alcuni insetti vettori, tutti appartenenti alla superfamiglia Coccoidea, famiglie Pseudococcidae e Coccidae ed è stata proposta per la trasmissione una modalità di tipo semipersistente. Le cocciniglie vettrici sono caratterizzate da nutrizione floemomiza e limitata mobilità. Le specie della famiglia Pseudococcidae manifestano comunque una mobilità maggiore rispetto alle altre cocciniglie e per questo sono considerate i vettori più importanti. Sino ad ora la composizione specifica della Pseudococcidofauna dei vigneti dell'Italia Nord-Occidentale era totalmente sconosciuta e si presumeva essere simile a quella di altri areali italiani indagati. Similmente l'incidenza dell'infezione virale nelle popolazioni naturali di Pseudococcidi in vigneto era sconosciuta. Sebbene per le specie vettrici sia stata segnalata la capacità di trasmissione di più virus, la qualità dell'infezione virale delle cocciniglie in natura, singola o mista, era altrettanto sconosciuta. Infine le informazioni sulle relazioni virus-vettore si limitano alla conoscenza su una persistenza limitata a 2-3 giorni dell'infettività del vettore. Gli scopi della ricerca sono stati: ¿ completare una chiave di identificazione molecolare, rapida e applicabile su tutti gli stadi vitali, delle specie di pseudococcidi della vite ¿ censire le specie di pseudococcidi vettori presenti nei vigneti dell'Italia Nord-Occidentale ¿ mettere a punto una diagnosi molecolare sensibile e specifica in real time PCR per il rilevamento dei virus associati al leaf roll e al legno riccio in singoli individui degli insetti vettori ¿ indagare l'infettività delle popolazioni naturali degli pseudococcidi nei vigneti dell'Italia Nord-Occidentale ¿ mettere a punto un sistema di quantificazione dei virus negli insetti vettori che permetta di studiare le relazioni virus-vettore in condizioni sperimentali controllate Infine, per la messa a punto di un sistema di quantificazione dei virus GLRaV-1, GLRaV-3 e GVA negli pseudococcidi vettori sono stati studiati tre ¿housekeeping gene¿ di cui è stata analizzata la stabilità di espressione in diversi stadi vitali di Pl. citri e Pl. ficus. Il gene gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi è stato scelto come miglior gene housekeeping da utilizzare come riferimento quantitativo nei saggi di real time PCR per descrivere l'andamento del titolo virale negli insetti vettori.| File | Dimensione | Formato | |
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