CRISPRoff editing epigenomico

Un’alternativa valida al controllo dell'espressione genica senza l’alterazione della sequenza di DNA d’interesse è la manipolazione del paesaggio epigenetico. La riscrittura dell'epigenoma sorge come promettente opzione al gene editing, resa possibile dai meccanismi d’insieme che sottostanno a CRISPRoff e CRISPRon, due tecnologie per la programmazione della scrittura e la cancellazione di memorie epigenetiche. CRISPRoff scrivere un programma trascrizionale stabile, che viene ricordato dalle cellule senza espressione costitutiva di modulatori epigenetici. Si tratta di uno scrittore programmabile di memoria epigenetica composto da una singola proteina di fusione “dCas9” in grado di stabilire specifici programmi di silenziamento e modifiche repressive degli istoni. La sua espressione transeunte mette a tacere in modo duraturo l'espressione, che le cellule umane mantengono per più di 450 divisioni cellulari. Identifichiamo nel sistema CRISPRoff singoli RNA guida (sgRNA) in grado di lavorare sulla grande maggioranza dei geni, andando ad includere anche quelli privi di isole CpG (CGIs). La metilazione mirata del DNA anche al di fuori dei CGI annotati può portare a un robusto silenziamento, indicando che l'editing epigenetico non è limitato ai geni con annotazioni CGI e può essere indirizzato verso la maggior parte dei geni codificati nel genoma umano; estendendo il modello canonico del silenziamento basato sulla metilazione. CRISPRoff può essere programmato da proteine ortogonali leganti il DNA, utilizzate per comprendere in modo più completo il percorso del silenziamento genico multiplo, chiarendo come le cellule in grado di silenziare un gene hanno una maggiore probabilità di mettere a tacere gli altri geni mirati. Il potenziale di reversibilità è una proprietà essenziale per l’editing dell’epigenoma. Per l’inversione del silenziamento mediato da CRISPRoff è sufficiente la deplezione della metilazione del DNA. Con CRISPRon si è realizzata la possibilità di modulare la cinetica della riattivazione, proponendo proteine di fusione funzionali per il reclutamento del macchinario trascrizionale e per l’aumento della trascrizione dei geni endogeni. Questi sistemi rendono l'editing programmabile dell'epigenoma sintonizzabile e reversibile, senza l’inserimento tradizionale di rotture del DNA, aggirando efficacemente la tossicità cellulare associata all'editing genico. Più in generale, CRISPRoff oltre a fornirci uno strumento utile per il controllo dell'espressione, ci aiuta ad affrontare domande fondamentali riguardanti il meccanismo e l'esplorazione dei principi dell'eredità epigenetica facilitandoci, la comprensione delle regole biologiche alla base del silenziamento epigenetico e del targeting degli enhancer.