Fattori di trascrizione WOX di vite: analisi dei promotori mediante l'utilizzo di un sistema eterologo

The WUSCHEL (WUS)-related homeobox (WOX) gene family is an important class of homeodomain (HD) transcription factors involved in the early phase of embryogenesis and lateral organ development. Bioinformatics approaches confirmed the presence of WOX homolog genes in different plant species, as in Vitis vinifera, in which 12 WOX genes have been identified. It has recently been reported that several VvWOX genes are expressed at different levels in two V. vinifera cultivars, 'Chardonnay' and 'Cabernet Sauvignon', characterized by a different embryogenic aptitude, high and low respectively. The aim of this work is to investigate if the different WOX gene expression profiles observed during the embryogenic process in these two grapevine cultivars could be correlated to the sequence variability at the promoter level. For this reason we decided to focus our attention on the promoter regions proximal to 5'-end of some VvWOX genes cloned from 'Chardonnay' (CH) and 'Cabernet Sauvignon' (CS). The activity of these promoters was tested in vivo using a heterologous system consisting of transformed plants of Arabidopsis thaliana, since the grapevine transformation is a slow process with a very low percentage of success. This work is organized in 3 main sections: 1. About 2000 bp from the 5' of VvWOX1, VvWOX6, VvWOX9, VvWOX13B genes were isolated from both CS and CH and sequenced to verify nucleotide variants. Since the CH and CS sequences of the VvWOX6 promoter showed significant differences, we decided to analyze both CS and CH promoters. Conversely, no significant differences emerged from the CH and CS comparison of VvWOX1, VvWOX9 and VvWOX13B promoters. In this case, we analyzed CH promoter sequences only. 2. Arabidopsis wild-type plants were transformed by use of Agrobacterium tumefaciens containing the expression vector pMDC164 carrying the GUS gene under the control of the promoters identified at point 1). The Arabidopsis were growing in a selective medium and the analyses were carried out in the F3 generation. Histochemical GUS assays were performed in parallel to real-time RT-PCR (qRT-PCR) aimed to quantify the GUS gene expression level. The GUS colorimetric assay showed an higher staining in all the organs of the transgenic Arabidopsis carrying the pVvWOX6CS-GUS in comparison to plants transformed with pVvWOX6CH-GUS. Meanwhile, pVvWOX1CH-GUS transformed plants showed a partial staining in cotyledons from young plantlets and in leaf margins, whereas the pVvWOX13BCH-GUS induced GUS expression specially in the mature organs. The relative expression levels of GUS mRNA was determined by qRT-PCR and it confirmed the GUS assay results for all the constructs. The analyses of pVvWOX9CH-GUS transformed Arabidopsis are still ongoing. 3. The last section of this work investigates the expression levels in grapevine of the 4 VvWOX genes considered above. qRT-PCR analyses for gene expression were performed in different organs of CH and CS. These four genes were expressed in different ways in several grapevine tissues, confirming generally the expression profile previously detected in the transgenic Arabidopsis. The results of this work showed how the different expression levels of some VvWOX genes detected in two cultivars of the same species (grapevine) are associated to variability in the promoter sequences. The next step of this work will be to confirm the activity of the most interesting promoters in grapevine

La famiglia genica WUSCHEL-related homeobox (WOX) costituisce una classe di fattori di trascrizione coinvolti nelle prime fasi di sviluppo dell'embriogenesi e degli organi laterali delle piante. Mediante approcci bioinformatici sono stati individuati omologhi di geni WOX in diverse specie, come in Vitis vinifera, dove ne sono stati identificati 12. In studi precedenti, è stato dimostrato che in due cultivar di V. vinifera ('Chardonnay' e 'Cabernet Sauvignon'), con una diversa attitudine all'embriogenesi (alta e bassa rispettivamente), diversi geni WOX presentano dei livelli di espressione molto diversi. Lo scopo di questo lavoro consiste nell'indagare la possibilità che questa differenza di espressione sia correlata alla variabilità di sequenza a livello dei promotori dei geni WOX. A tal fine si è deciso di studiare le regioni prossimali al 5' di alcuni di questi geni in 'Chardonnay' (CH) e 'Cabernet Sauvignon' (CS). L'attività di questi promotori è stata saggiata in vivo in un sistema eterologo costituito da piante trasformate di Arabidopsis thaliana, in quanto la trasformazione in vite è un processo molto lento e con percentuali di successo molto basse. Il lavoro è costituito da 3 parti principali: 1) Sono state clonate e sequenziate circa 2000 bp al 5' dei geni VvWOX1, VvWOX6, VvWOX9, VvWOX13B isolati sia da CS che da CH. A livello del promotore VvWOX6 si sono osservate delle differenze di sequenza tra CH e CS e si è quindi deciso di analizzare i due promotori in modo separato. Viceversa, a livello dei promotori degli altri geni, non essendo state rilevate differenze significative tra le due cultivar, si è scelto di analizzare solamente le sequenze isolate da CH. 2) Piante di Arabidopsis sono state trasformate con Agrobacterium tumefaciens con un vettore di espressione contenente il gene reporter GUS sotto il controllo dei promotori individuati nel punto 1). Le piante di Arabidopsis cresciute in terreno selettivo sono state portate a seme fino alla generazione F3 su cui sono state realizzate le analisi. Sono stati effettuati saggi istochimici GUS condotti in parallelo a real-time RT-PCR (qRT-PCR) volti a quantificare il livello di espressione del gene GUS. Il saggio GUS ha evidenziato una maggiore colorazione su tutti gli organi delle piante trasformate con il costrutto pVvWOX6CS-GUS rispetto a quelle trasformate con pVvWOX6CH-GUS. Il costrutto pVvWOX1CH-GUS ha indotto una colorazione parziale dei cotiledoni e dei margini delle foglie, mentre Arabidopsis contenenti pVvWOX13BCH-GUS hanno mostrato una colorazione maggiore nelle fasi più avanzate dello sviluppo. Il livello di espressione del gene GUS valutato mediante qRT-PCR ha sostanzialmente confermato i risultati osservati con il saggio istochimico in tutti i costrutti. Le analisi delle piante trasformate con pVvWOX9CH-GUS sono ancora in corso. 3) L'ultima parte del lavoro è stata dedicata allo studio dei livelli di espressione in diversi organi di CH e CS dei 4 geni VvWOX considerati. I geni vengono espressi nei vari organi in modo differenziale, ricalcando in gran parte l'espressione osservata nelle piante trasformate di Arabidopsis. I risultati di questo lavoro hanno evidenziato come le differenze di espressione di alcuni geni VvWOX rilevate in due cultivar di vite siano legate a variazioni di sequenza a livello delle regioni prossimali al 5' dei geni. La fase successiva del lavoro sarà confermare l'attività di alcuni di questi promotori maggiormente interessanti in vite