Golde Rice: miglioramento genetico e introgressione nel germoplasma di Oryza sativa subsp. indica

Rice represents the main food for the developing Countries, but because of its deficient in β¿carotene, it may cause the Vitamin A Deficiency (VAD), disease that afflicts approximately 2 billion of peoples in 118 Countries, according to the World Health Organization. VAD causes many diseases, among which the most serious are loss of vision in situation of low brightness, xerophthalmia and in the most severe cases the blindness. Vitamin A may be taken by the humans only through the alimentation. The foods of animal origin (liver, milk, cheese, eggs and butter) allow the direct contribution of vitamin A, but also of cholesterol; foods of plant origin (fruits and vegetables such as carrots, corn, apricots and vegetable oils), instead, allow to introduce the Vitamin A in the form of its precursor, the β-carotene. Since conventional supports didn't lead to significant progress, in 2004 the scientists I. Potrikus and P. Beyer patented the Golden Rice, transgenic variety of rice enriched with β-carotene, thanks to the introduction of key genes for its synthesis into the rice genome. In the present thesis, I reported two different techniques used in laboratory to obtain carotenoid enriched transgenic plants of cultivar IR64 and BR29 belonging to subsp. indica, the most cultivated in Asia and in Bangladesh, respectively. The first technique involved the transformation with Agrobacterium tumefaciens of the cultivar IR64 and BR29 with genes psy and crtI, indispensable for the synthesis of β-carotene. From these T_0 plants, the seeds T_1, were showing visually the presence of carotenoids thanks to yellow pigmentation of kernels, were obtained. From these T_1 plants, the T_2 generation has subsequently obtained. The second method involved, instead, the introgression of biosynthetic pathway of β-carotene through the cross of the transgenic T309 cultivar subsp. japonica and the IR64 cultivar subsp. indica and the construction of nearly isogenic introgression lines (NIILs), up to the BC_2 F_2 progeny, homozygous for the crtI and psy genes, and that showed the highest phenotypic similarity to the IR64 parental. Comparing the two methods described above, it can be said that the best results were obtained with the direct insertion of genes responsible for the production of β-carotene through transformation with Agrobacterium. Some plants of T_2 progeny, in fact, showed a final quantity in β-carotene to 3,92 µg/g in the BR29 cultivar and to 0,96 µg/g in the IR64 cultivar. Instead, lower values were obtained from NIILs, achieving, in the BC_2 F_2 progeny, a quantity of 1,8 µg/g in the presence of the three genes, and of 1,06 µg/g with the only presence of psy and crtI genes. Despite the positive agronomic performance and the stability of β-carotene in both methods, the Golden Rice has not yet gone into culture, because of the criticism of numerous organizations and because of the precautionary legislation. In response to the criticism, the Humanitarian Golden Rice Project was born, supported by several associations and it may provide the free distribution of Golden Rice to the populations in developing Countries. Today the campaign ¿Allow Golden Rice Now¿, conducted by Patrick Moore co-founder and ex leader of Greenpeace, has the aim of distributing the Golden Rice to the farmers, as the deficiency of vitamin A continues to affect approximately 6000 victims a day.

Il riso rappresenta l'alimento principale di sostentamento per i Paesi in via di sviluppo, ma poiché privo di β-carotene è causa della Vitamin A deficiency (VAD), malattia che affligge circa 2 miliardi di individui in 118 Paesi secondo la World Health Organization. La VAD causa molte patologie, tra cui la perdita della vista in situazione di bassa luminosità, la xeroftalmia e in casi più gravi la cecità. La Vitamina A può essere apportata agli uomini solo attraverso l'alimentazione. I cibi di origine animale (fegato, latte, formaggi, uova e burro) permettono l'apporto diretto di Vitamina A, ma anche di colesterolo; gli alimenti di origine vegetale (frutti e ortaggi quali carote, granoturco, albicocche e oli vegetali), invece, permettono di introdurre la vitamina A sotto la forma del suo precursore, il β-carotene. Poiché gli aiuti convenzionali non portarono progressi significativi, nel 2004 gli scienziati I. Potrikus e P. Beyer brevettarono il Golden Rice, varietà transgenica di riso arricchita di β-carotene, grazie all'introduzione nel genoma di riso dei geni chiave per la sua sintesi. Nella tesi ho affrontato due diverse tecniche utilizzate in laboratorio per ottenere cariossidi arricchite in provitamina A, nella parte edibile, delle cultivar IR64 e BR29 appartenenti alla subsp. indica, le più coltivate rispettivamente in Asia e nel Bangladesh. Una prima tecnica prevedeva la trasformazione con Agrobacterium tumefaciens delle cultivar IR64 e BR29 con i geni psy e crtI, indispensabili per la sintesi del β-carotene. Da queste piante T0 si sono ottenuti i semi T1 che, dopo raffinazione, mostravano visivamente la presenza di carotenoidi grazie alla pigmentazione gialla delle cariossidi, e successivamente si è ottenuta la generazione T2. Il secondo metodo prevedeva, invece, l'introgressione del pathway biosintetico del β-carotene attraverso l'incrocio della cultivar transgenica T309 subsp. japonica e la cultivar IR64 subsp. indica e la costruzione di linee di introgressione quasi isogeniche (NIILs), fino ad arrivare alle progenie BC_2 F_2, omozigoti per i geni crtI e psy, e che mostravano la massima similarità fenotipica al parentale IR64. Confrontando i due metodi sopra riportati, si può affermare che i migliori risultati sono stati ottenuti con la diretta inserzione dei geni responsabili della produzione di β-carotene attraverso la trasformazione con Agrobacterium. Alcune piante della progenie T2, infatti, mostravano un quantitativo finale in β-carotene di 3,92 µg/g nella cultivar BR29 e di 0,96 µg/g nella cultivar IR64. Valori più bassi si sono, invece, ottenuti dalle NIILs, conseguendo, nella progenie BC_2 F_2, una quantità di 1,8 µg/g in presenza dei tre geni, mentre di 1,06 µg/g con la sola presenza dei geni psy e crtI. Nonostante le positive performance agronomiche e la stabilità del β-carotene in entrambi i metodi, il Golden Rice non è ancora coltivato, a causa delle critiche mosse da numerose organizzazioni e a causa della normativa precauzionale tuttora vigente. In risposta alle critiche è nato il Progetto Umanitario Golden Rice appoggiato da numerose associazioni che prevede la distribuzione gratuita del Golden Rice alle popolazioni nei Paesi in via di sviluppo. Oggi la campagna ¿Allow Golden Rice Now¿, condotta da Patrick Moore, cofondatore ed ex leader di Greenpeace, ha l'obiettivo di distribuire il Golden Rice agli agricoltori, in quanto la carenza in vitamina A continua a colpire circa 6000 vittime al giorno.