GPR21 e macrofagi: l'effetto del silenziamento genico sul rilascio di citochine e sulla migrazione cellulare

GPR21 is an orphan, constitutively active receptor belonging to the G-Protein Coupled Receptors superfamily. Studies of GPR21 knock-out mice have pointed out that this receptor could be involved in the development of obesity-induced insulin resistance. It seems that GPR21 plays an important role in the induction of macrophage migration, therefore concurring to the development of chronic low-grade inflammation, a condition typical of various diseases, particularly metabolic ones. Nevertheless, this receptor is still little studied and, mostly, its effect on macrophages, cells who play an important role in inflammation, is still unclear. The aim of this thesis, therefore, was to evaluate the effect of GPR21 gene silencing on the release of pro- and anti-inflammatory cytokine from macrophages and its effect on their migration. Thus, human monocytic cells THP-1 were differentiated and activated into pro-inflammatory, M1, and anti-inflammatory, M2, macrophages in which GPR21 was silenced at the gene level by siRNA, compared to the control macrophages, transfected with an empty vector (scramble). After the specific gene silencing of GPR21, the gene expression and release of the pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β from M1 macrophages, evaluated with Real-Time PCR and E.L.I.S.A., were significantly reduced. Conversely, the gene expression and release of the anti-inflammatory cytokine IL-10 from M2 macrophages were not altered in a significant manner. With the Boyden chamber assay, after the downregulation of the receptor at the gene level, M1 macrophages have shown a reduced migratory ability towards the chemokine CCL7, while M2 macrophages migration was significantly increased. These results support the hypothesis of a possible involvement of GPR21 in the induction of pro-inflammatory macrophages migration and suggest its possible role in the release of pro-inflammatory cytokines, events related to the development of chronic low-grade inflammation. Hence, counteracting GPR21 activity could be useful to reduce this inflammatory state and to prevent the progression of related diseases; thus, its function and the underlying mechanisms of action deserve to be further investigated.

GPR21 è un recettore orfano, costitutivamente attivo, che fa parte della “superfamiglia” dei recettori accoppiati a proteine G. Studi su topi GPR21 knock-out hanno evidenziato un suo possibile coinvolgimento nello sviluppo di insulino-resistenza correlato all’obesità. In particolare, sembra che GPR21 sia coinvolto nell’induzione della migrazione dei macrofagi, contribuendo quindi allo sviluppo di uno stato infiammatorio cronico di basso grado che è tipico di molteplici patologie, soprattutto in ambito metabolico. Tuttavia, il recettore è ancora poco conosciuto e soprattutto non è chiaro quale sia il suo effetto nei macrofagi, cellule che giocano un importante ruolo nel fenomeno infiammatorio. Scopo di questa tesi è stato, pertanto, indagare l’effetto del silenziamento genico di GPR21 sul rilascio di citochine pro- ed anti-infiammatorie da parte dei macrofagi e sulla capacità migratoria di queste cellule. A tal fine, le cellule monocitiche umane THP-1 sono state differenziate e attivate in macrofagi M1, pro-infiammatori, ed M2, anti-infiammatori, sottoposte a silenziamento genico tramite siRNA e confrontate con i macrofagi di controllo, che sono stati invece transfettati con un vettore vuoto (scramble). In seguito al silenziamento genico di GPR21, l’espressione genica e il rilascio delle citochine pro-infiammatorie TNF-α e IL-1β da parte dei macrofagi M1, valutati tramite Real-Time PCR ed E.L.I.S.A., sono stati significativamente ridotti. Invece, l’espressione e il rilascio della citochina anti-infiammatoria IL-10 da parte dei macrofagi M2 non sono stati alterati in maniera significativa. Tramite il saggio di Boyden è stato osservato che, in seguito alla down-regolazione del recettore a livello genico, i macrofagi M1 hanno presentato una ridotta capacità migratoria verso la chemochina CCL7, mentre la migrazione dei macrofagi M2 è stata significativamente aumentata. Questi risultati supportano l’ipotesi di un possibile coinvolgimento del recettore GPR21 nell’indurre la migrazione dei macrofagi di tipo pro-infiammatorio e suggeriscono un suo ruolo nel rilascio di citochine pro-infiammatorie, fattori correlati con l’insorgenza dello stato infiammatorio cronico di basso grado. Contrastare l’attività di GPR21 potrebbe quindi essere utile per ridurre questo stato infiammatorio e ostacolare la progressione delle patologie ad esso correlate; perciò, la sua funzione e i meccanismi d’azione sottostanti meritano di essere ulteriormente approfonditi.