Nuovi inibitori farmacologici dell'inflammasoma NLRP3 studi in vitro.

Inflammasomes are multi-protein complexes that form inside cells to stimulate the host’s defence mechanisms against different types of pathogens (Sharma et al, 2016). When over-stimulated, this complex is implicated in the pathogenesis of some auto-inflammatory diseases (Sharma et al, 2021). Evidence suggests that the inflammasome is one of the components involved in the onset of some types of tumours such as colorectal cancer. Inflammasome activation leads to a distinct form of cell death called pyroptosis (Carty et al, 2021). Inflammasomes are divided into two families: the ALR family, to which the Absent In Melanoma 2 (AIM2) family belongs, and the NOD-like receptor (NLR) family, to which NLRP1, NLRP3, NLRC4, NLRP6 and NLRP12 belong. Inhibition of these inflammasomes could be a tool for treating diseases involving them (Man et al, 2018). The aim of this thesis was to evaluate the ability of new compounds synthesized by the SynBioMed laboratory of the Department of Drug Science and Technology to inhibit NLRP3 inflammasome activation, starting from known NLRP3 inhibitors (Gastaldi et al, 2021). To this end, the ability of these compounds, at a concentration of 10 µM, to inhibit death by pyroptosis and the release of cytokines, such as IL-1β, by THP-1 cells differentiated with forbol-myristate-acetate and in which the NLRP3 inflammasome was activated for 4 hours with LPS (10 µg/mL) and subsequently for 90 minutes with ATP (5 mM) or nigericin (20 µM) was assessed. By western blot, the ability to modulate the levels of proteins involved in the NLRP3 signalling pathway, both in the supernatant and in the cell lysate, was assessed. Finally, the cytotoxicity of the compounds at 72h was assessed using the MTT assay. The results showed that INF 150 and INF 195 are able to significantly reduce cell death by pyroptosis and IL-1β release when the inflammasome is activated with ATP, with activity comparable to that of a known NLRP3 inhibitor, MCC950. However, further studies are needed to confirm the ability of these compounds to inhibit nigerin-induced inflammasome activation.

Gli inflammasomi sono complessi multiproteici che si formano all’interno delle cellule per stimolare i meccanismi di difesa dell’ospite contro diverse tipologie di patogeni (Sharma et al, 2016). Questo complesso se sovra-stimolato risulta essere implicato nella patogenesi di alcune malattie auto-infiammatorie (Sharma et al, 2021). Numerosi test indicano che l’inflammasoma è coinvolto nell’insorgenza di tumori come il tumore colon-rettale. L’attivazione dell’inflammasoma porta ad una forma distinta di morte cellulare definita piroptosi (Carty et al, 2021). Gli inflammasomi si distinguono in due famiglie: la famiglia degli ALR, a cui appartiene ad esempio la famiglia degli Absent In Melanoma 2 (AIM2), e la famiglia dei NOD-like receptor (NLR) di cui fanno parte NLRP1, NLRP3, NLRC4, NLRP6 e NLRP12. L’inibizione di questi inflammasomi può essere uno strumento per il trattamento delle patologie in cui sono coinvolti (Man et al, 2018). Lo scopo della tesi è stato valutare la capacità di nuovi composti sintetizzati dal laboratorio di SynBioMed, del Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco, di inibire l’attivazione dell’inflammasoma NLRP3 a partire da inibitori noti di NLRP3 (Gastaldi et al, 2021). A tale scopo è stata valutata la capacità di questi composti, alla concentrazione di 10 µM, di inibire la morte per piroptosi e il rilascio di citochine, come IL-1β, da parte di cellule THP-1 differenziate con forbolo-miristato-acetato; in cui l’inflammasoma NLRP3 è stato attivato per 4 ore con LPS (10 µg/mL) e successivamente per 90 minuti con ATP (5 mM) o nigericina (20 µM). Attraverso il western blot, è stata valutata la capacità di modulare i livelli di proteine coinvolte nella via di segnale di NLRP3, sia nel surnatante che nel lisato cellulare. Infine, è stata valutata la citotossicità dei composti a 72h usando il saggio MTT. I risultati ottenuti hanno evidenziato come INF 150 e INF 195 siano in grado di ridurre significativamente la morte cellulare per piroptosi e il rilascio di IL-1β quando l'inflammasoma è attivato con ATP con attività paragonabile a quella di un noto inibitore di NLRP3, MCC950. Risultano invece necessari ulteriori studi per confermare la capacità di questi composti di inibire l'attivazione dell’inflammasoma indotta con la nigericina.