Effetto biologico dell’inibitore anti Polo-like-kinase 1 (BI2536) in linee cellulari di osteosarcoma canino

Osteosarcoma (OSA) is the most common form of malignant bone cancer in dogs, and, because of the rapid growth and the high metastasis rates, it’s characterized by poor prognosis. Despite of recent progress in identifying mutation hotspots and aberrant oncogenic signalling pathways affecting this tumour, therapeutic approaches are still very limited and not curative. The polo-like kinase 1 (PLK1) is one of the main drivers of cancer cell growth and proliferation. Besides this, PLK1 contributes to stabilization and regulates the expression of c-MYC, one of the most important transcription factors involved in human and canine tumours. PLK1 and c-MYC have been found to be highly expressed in the malignant cells of a variety of human cancers, including OSA. Thus, PLK1 is expected to be a potential target for human cancer therapy. BI2536 is a small-molecule inhibitor of PLK1, which through inhibiting PLK1 enzymatic activity, inhibits cell proliferation, induces cancer cell apoptosis, and causes the decline in c-MYC protein abundance, in many human tumours. Within this context, the biological effect of PLK1 inhibition has been deeply investigated in human OSA, whereas it little is known about its effect in canine OSA. However, due to similarities in biological, molecular, and clinical features of canine and human OSA, it is reasonable to suspect that PLK1 could represent a potential therapeutic target also in dogs. This study aimed to evaluate the biological effect of BI2536 in canine OSA cell lines. In particular, the purpose of the study was to analyse cell proliferation, apoptosis, mRNA, and protein levels of PLK1 and c-MYC after the treatment by BI2536. Firstly, PLK1 and c-MYC gene and protein expression were examined through qRT-PCR and Western Blot analysis in four canine OSA cell lines (D17, D22, Penny and Wall). Given the higher transcript and protein levels, D17 cell line was selected for further experiments with BI2536. Preliminary viability assays were performed to assess the optimal culture conditions (number of cells and time of cultivation) and the in vitro BI253 sensitivity of D17 cell line. Given the results, cells (3000/well) were treated at 2,5nM, 5nM, and 7,5nM concentrations for 12 h and 24 h and then viability assay, apoptosis assay, and qRT-PCR analysis were performed. To determine whether BI2536 affected PLK1 and c-MYC protein expression, cells were treated at 5nM, 10nM, 15nM, 25nM and 50nM concentrations for 24 h and Western Blot analysis were performed. The results showed that PLK1 and c-MYC gene and protein expression was high in all OSA cell lines. Through viability and apoptosis assay was demonstrated that BI2536 inhibits cell proliferation and induces cell apoptosis in a dose-dependent manner. As shown by the Western Blot results, the treatment with high concentrations (>10nM) of BI2536 is associated with a marked dose-dependent decline in c-MYC expression. These findings confirm that human and canine OSA has common biological and molecular features and reinforce the potential role of PLK1 as a therapeutic target in canine OSA. The study demonstrated that BI2536 mediated inhibition of PLK1, leads to biological effects that likely could be usefully in the treatment of canine OSA, especially when characterized by c-MYC-over-expression. These data also highlight that BI2536 achieves biological effects only by using doses close to toxic limits and this is one of the main factors restraining its clinical utility.

L’osteosarcoma (OSA) è la più comune forma di neoplasia maligna primaria dell’osso nel cane. A causa della rapida progressione e dell’alto indice metastatico, è caratterizzata da una prognosi sfavorevole. Nonostante i recenti progressi nella caratterizzazione genetica e molecolare di questa neoplasia, gli approcci terapeutici rimangono ancora limitati e non curativi. Polo-like kinase 1 (PLK1) è uno dei maggiori promotori della proliferazione delle cellule neoplastiche; inoltre, contribuisce alla modulazione dell’espressione di c-MYC, uno dei fattori di trascrizione oncogeni maggiormente coinvolti nella patogenesi dei tumori umani e canini. La sovra espressione di PLK1 e c-MYC è stata riscontrata in numerose neoplasie umane, compreso l’OSA. Pertanto, in oncologia umana, PLK1 è considerato un promettente target molecolare per lo sviluppo di terapie mirate. BI2536 è un inibitore molecolare di PLK1, che nelle linee di OSA umano, inibisce la proliferazione cellulare, induce l’apoptosi delle cellule neoplastiche e deprime la sintesi di c-MYC. Al momento, nessun dato è noto sull’effetto dell’inibizione farmacologica di PLK1 nell’OSA canino; tuttavia, considerando le analogie esistenti tra l’OSA umano e quello canino, è verosimile che questa, possa essere una strategia terapeutica valida anche per il trattamento della neoplasia canina. In questo lavoro è stato analizzato l’effetto biologico di BI2536 in linee cellulari di OSA canino, su proliferazione, apoptosi, espressione trascrizionale e proteica di PLK1 e c-MYC. Per l'esecuzione dell'esperimento, è stata valutata l’espressione genica e proteica di PLK1 e c-MYC su 4 linee di OSA canino (Penny, Wall, D17 e D22) rispettivamente tramite analisi qRT-PCR e Western Blot. In base ai relativi livelli di espressione, la linea D17 è stata selezionata per i saggi di trattamento con BI2536. Le cellule (3000/pozzetto) sono state trattate alle concentrazioni di 2,5nM, 5nM e 7,5nM per 12 e 24 ore e l’effetto biologico del farmaco è stato valutato mediante saggio di proliferazione, saggio di apoptosi e analisi qRT-PCR. Per determinare se BI2536 influenza l’espressione proteica di PLK1 e c-MYC, è stata eseguita l’analisi Western Blot sulle cellule trattate alla concentrazione di 5nM, 10nM, 15nM, 25nM e 50nM per 24 ore. I risultati hanno evidenziato che tutte le linee cellulari analizzate esprimono elevati livelli trascrizionali e proteici di PLK1 e c-MYC. Dai saggi di vitalità e apoptosi è emerso che, dopo 24 ore di trattamento, BI2536 inibisce la proliferazione e attiva il segnale apoptotico con un’azione dose-dipendente. Inoltre, l’analisi Western Blot ha dimostrato che l’utilizzo di dosi elevate (>10 nM) di BI2536 determina una depressione dell’espressione proteica di c-MYC, progressivamente crescente all’aumentare della dose utilizzata. Questi risultati confermano l’esistenza di analogie molecolari e biologiche tra l’OSA canino e la controparte umana, suffragando l’ipotesi che PLK1 possa essere un target promettente per lo sviluppo di terapie innovative anche in oncologia veterinaria. Infatti, BI2536 determina degli effetti biologici potenzialmente sfruttabili nel trattamento degli OSA canini, in particolare in quelli caratterizzati dalla sovra espressione di c-MYC. Tuttavia, è stato evidenziato che per ottenere gli effetti biologici a livello cellulare è necessario l’utilizzo di dosi prossime a quelle tossiche, e questo rappresenta una delle maggiori limitazioni al suo utilizzo nella pratica clinica.