La variabilità genetica del Citomegalovirus umano: possibili implicazioni dal punto di vista clinico, immunologico e virologico.

Human cytomegalovirus (HCMV) is a double-stranded DNA virus with ubiquitous distribution around the world. In immunocompromised hosts, HCMV has the ability to determine severe infections, with high morbidity and mortality. A paradigmatic example of what HCMV is capable of is the infection acquired during pregnancy, which leads to the congenital HCMV infection of newborns. In terms of congenital infection, the severity of the clinical situation is determined by the time of maternal infection during pregnancy: newborns infected during the first phases of pregnancy usually presents with greater morbidity and long-term sequelae during infancy. Despite the great amount of cases of congenital HCMV infection, the mechanisms underlying the ability of HCMV to determine infections with great differences in terms of severity are only partially understood. In this study, we aimed to identify a correlation between the phenotypical characteristics and immunomodulatory ability of different strains of HCMV, clinically isolated from organic samples (urine) of newborns with HCMV congenital infection, and the clinical phenotype presented by the patients. In particular, we aimed to identify which virological features determine not only a more severe congenital HCMV infection in utero and in the neonatal period, but also a greater number of long-term sequelae during. In this study, we considered a population of 21 newborns diagnosed with congenital HCMV infection at the Neonatal Care Unit of Neonatology at the Sant'Anna Hospital of Turin, during the period of April 2015 and September 2017. The growth properties of the HCMV isolates were analyzed in different colture models. Genetic polymorphism was assessed by genetic analysis of viral genes involved in drug resistance (UL54 and UL97). Moreover, we sought to determine whether inter-host phenotipic variability of HCMV influences its ability to modulate NK cell responses to infection and consequently the its ability to determine a more severe congenital infection. For this purpose, we selected five HCMV clinical isolates from the considered cohort of patients and analyzed the expression of several ligands for specific NK cell-activating receptors. We also studied the IFN-ɣ production by NK cells co-cultured with HCMV-infected fibroblasts, in order to correlate the expression of the ligands with the functionality of the immunitary system cells. Our findings indicate that exist a great variability of replicative behaviour and genetic polymorphisms between the HCMV strains studied. While the genetic polymorphisms didn’t show influence on the severity of the infection, we observed that that the replicative behavour’s variability influeces the immunomodulatory ability of HCMV, leading to more severe congenital infections and long-term sequelae.

Il Citomegalovirus umano (HCMV) è un virus a DNA a doppio filamento, con distribuzione ubiquitaria, in grado di determinare quadri infettivi significativa gravità in condizioni di immunocompromissione dell’organismo ospite. Un esempio paradigmatico in questo senso è dato dall’infezione in gravidanza, che porta all’infezione congenita da HCMV nel neonato. Nel contesto dell’infezione congenita da HCMV, le conseguenze cliniche risultano tanto più gravi quanto più precocemente il neonato è venuto a contatto con il virus in epoca fetale, determinando significative morbidità e sequele a lungo termine. Nonostante l’elevato numero di casi, gran parte dei meccanismi tramite cui HCMV determina quadri clinici di differente gravità risultano ancora ignoti. L’obiettivo del presente lavoro di Tesi di Laurea è quello di identificare un’eventuale correlazione tra le differenze fenotipiche e immunomodulatorie di diversi ceppi di HCMV, isolati clinicamente da campioni organici provenienti da neonati con infezione congenita, e il quadro clinico presentato dai pazienti, evidenziando eventuali caratteristiche virologiche predittive di maggior rischio di sviluppare sintomatologia in utero e alla nascita, oltre che gravi sequele a lungo termine. A tal fine, sono stati considerati 21 neonati con infezione congenita da HCMV all’Ambulatorio di Infezioni Congenite della SC Neonatologia Universitaria dell’Ospedale Sant’Anna di Torino nel periodo compreso tra Aprile 2015 e Settembre 2017. La crescita in vitro dei diversi ceppi di HCMV isolati a partire dai campioni di urina prelevata dai pazienti partecipanti allo studio è stata valutata in diversi modelli di crescita virale in vitro. È stato valutato il grado di polimorfismo genetico e il carico mutazionale, mediante sequenziamento genico, delle regioni del genoma virale maggiormente determinanti la suscettibilità ai farmaci antivirali (UL54 e UL97). Si è proceduto anche all’analisi dei livelli di espressione di specifici ligandi attivatori delle cellule NK da parte delle cellule infettate da alcuni selezionati ceppi isolati clinici, oltre che della produzione di IFN- da parte di cellule NK poste a contatto con cellule infette dagli stessi isolati. É stata evidenziata un’elevata eterogeneità fenotipica in termini di comportamento replicativo tra i ceppi di HCMV isolati clinici analizzati, oltre che un’elevata variabilità genetica dei geni analizzati. Tale eterogeneità si riflette anche nel comportamento di modulazione del sistema immunitario da parte del virus, mentre la variabilità genetica individuata non ha trovato riscontro clinico. Sono stati, inoltre, identificati alcuni ceppi virali con ridotta aggressività replicativa e ridotta capacità di attivazione del sistema immunitario in grado di determinare quadri clinici di maggiore gravità. I risultati ottenuti evidenziano un elevato grado di polimorfismo fenotipico, che si riflette nella capacità del virus di interagire con il sistema immunitario dell’ospite, rendendolo in grado di determinare quadri clinici di maggiore gravità.