Effetto delle vescicole extracellulari derivate da cellule staminali sul danno in cellule endoteliali corneali umane

BACKGROUND Extracellular vesicles (EVs) have recently been identified as mediators of an intercellular communication system. Based on their origin, they are able to perform different functions. Through a modification of the immune response, extracellular vesicles appear to promote tissue regeneration by creating a pro-regenerative environment and allowing endogenous stem cells and cell progenitors to successfully repair damaged tissues. In light of this, it seemed useful to investigate what the potential applications of these vesicular complexes could be if placed in a context of corneal endothelial suffering. The endothelial layer of the cornea has a particular damage response mechanism: its cells implement compensatory behavior (they can only migrate and increase in size) rather than regenerative. The consequence is therefore a reduction in the cell density of the tissue, which manifests itself with edema, decompensation and reduction of the corneal transparency. The current surgical therapeutic options for the management of corneal endothelial pathologies (keratoplastics) are associated with a high success rate, however, determining a significant impact on the homeostasis of the ocular surface. In fact, post-operative management is based on topical and systemic immunosuppressive therapies that last for about a year, with possible predisposition to adverse events on ocular tone and/or infectious diseases. Lastly, the execution of a keratoplasty presupposes the existence of a donor and the availability of suitable corneal tissues. The above problems push us to seek alternative solutions, and Regenerative Medicine seems to offer the best chances for the management of this class of pathologies. Therefore, this work aims to investigate whether stem cell EVs are able to induce recovery in damaged human corneal endothelial cells (HCECs). MATERIALS AND METHODS HCECs were isolated from 23 pathological corneal flaps removed by perforating keratoplasty. EVs were in turn isolated from bone marrow derived mesenchymal stem cells. The experimentation was conducted respecting the following steps: • Step 1: isolation and culture of HCECs. Tissues were enzymatically disrupted with collagenase and cells placed in a specific endothelial medium. The protein structure was assessed by Western Blot and flow cytometric analysis, and the RNA content by molecular biology methods. • Step 2: creating a damage model. The damage was standardized and recreated through growth factor deprivation, H2O2 incubation and mechanical stress. The assessment of the effects of the damage was carried out by analyzing apoptotic levels, the proliferation rate and the ability to repair wounds. • Step 3: effect of extracellular vesicles (EVs) on damaged human corneal endothelial cells. Assessment of recovery from damage using the same indicators as above following the administration of EVs. RESULTS The data emerged from our study indicate a real regenerative effect of EVs on damaged HCECs, which is expressed through an increase in the survival, proliferation and migration of treated cells.

BACKGROUND Le vescicole extracellulari (EVs) sono state recentemente identificate come mediatori di un sistema di comunicazione intercellulare. Sulla base della loro origine, sono in grado di svolgere differenti funzioni. Attraverso una modifica della risposta immune, le vescicole extracellulari sembrano favorire la rigenerazione tissutale creando un ambiente pro-rigenerativo e permettendo a cellule staminali endogene e a progenitori cellulari di riparare con successo tessuti danneggiati. Alla luce di ciò, è apparso utile indagare quali possano essere le potenziali applicazioni di questi complessi vescicolari se inseriti in un contesto di sofferenza endoteliale corneale. Lo strato endoteliale della cornea possiede un particolare meccanismo di risposta al danno: le sue cellule mettono in atto un comportamento di tipo compensatorio (possono solo migrare e aumentare di dimensioni) piuttosto che rigenerativo. La conseguenza è quindi una riduzione della densità cellulare del tessuto, che si manifesta con edema, scompenso e riduzione della trasparenza corneale. Le attuali opzioni terapeutiche chirurgiche per la gestione di patologie dell'endotelio corneale (cheratoplastiche) si associano a un elevato tasso di successo, determinando però un impatto notevole sull'omeostasi della superficie oculare. La gestione post-operatoria si fonda infatti su terapie immunosoppressive topiche e sistemiche che si protraggono per circa un anno, con possibile predisposizione a eventi avversi sul tono oculare e/o di tipo infettivo. In ultimo, l'esecuzione di una cheratoplastica presuppone l'esistenza di un donatore e la disponibilità di tessuti corneali idonei. Le problematiche di cui sopra ci spingono a ricercare soluzioni alternative, e la Medicina Rigenerativa sembra offrire le migliori chances per la gestione di questa classe di patologie. Pertanto, con questo lavoro si intende indagare se EVs derivate da cellule staminali siano in grado di indurre un recupero in cellule endoteliali corneali umane (HCECs) danneggiate. MATERIALI E METODI Le HCECs sono state isolate da 23 lembi corneali patologici rimossi mediante l'intervento di cheratoplastica perforante. Le EVs sono state a loro volta isolate a partire da cellule staminali mesenchimali derivate da midollo osseo. La sperimentazione è stata condotta rispettando i seguenti step: • Step 1: isolamento e coltura di HCECs. I tessuti sono stati disgregati enzimaticamente con collagenasi e le cellule poste in un medium specifico endoteliale. È stato valutato l'assetto proteico mediante Western Blot e analisi citofluorometrica, e il contenuto in RNA mediante metodiche di biologia molecolare. • Step 2: creazione di un modello di danno. Il danno è stato standardizzato e ricreato attraverso privazione di fattori di crescita, incubazione con H2O2 e stress meccanico. La valutazione degli effetti del danno è stata realizzata mediante analisi dei livelli apoptotici, del tasso di proliferazione e dell'abilità di riparazione delle ferite. • Step 3: effetto delle vescicole extracellulari (EVs) su cellule endoteliali corneali umane danneggiate. Valutazione del recupero dal danno utilizzando gli stessi indicatori di cui sopra in seguito alla somministrazione delle EVs. RISULTATI I dati emersi dal nostro studio indicano un vero e proprio effetto rigenerativo delle EVs sulle HCECs danneggiate, il quale si esplica attraverso un aumento della sopravvivenza, della proliferazione e della migrazione delle cellule trattate.