Analisi trascrittomica di fattori di virulenza e di risposta allo stress di Listeria monocytogenes in sistemi alimentari

Listeria monocytogenes pur non avendo un'incidenza elevata è in grado di causare patologie molto gravi nelle categorie di popolazione a rischio. Risulta inoltre un microrganismo difficile da tenere sotto controllo in quanto possiede numerosi meccanismi di resistenza e di adattamento agli stress. Il presente lavoro, sviluppato nell'ambito del progetto Pathogen Combat, ha avuto lo scopo di valutare come le condizioni ambientali di crescita batterica possono influenzare la fisiologia di L. monocytogenes in termini di espressione genica di fattori di risposta agli stress e correlati ai meccanismi di virulenza. Sono stati realizzati due brodi di coltura simulanti una matrice carne fresca ed un prodotto fermentato a base di carne, rappresentativi di diverse condizioni nelle quali il microrganismo patogeno può trovarsi nella filiera alimentare. Tali brodi di coltura sono stati contaminati con 3 diversi ceppi di L. monocytogenes (EGD-e, #3, #12) e lasciati sostare a 4°C al fine di simulare le condizioni di conservazione di un prodotto deperibile. Le colture batteriche così ottenute sono state analizzate con la tecnica dei microarray al fine di ottenere dei profili di espressione genica del microrganismo in ogni condizione. I geni presi in considerazione in questo lavoro sono stati circa cinquanta ed includono geni legati ai meccanismi di virulenza, geni legati ai meccanismi di difesa dagli stress ambientali e geni di regolazione dei precedenti o di pathway. È stata effettuata l'estrazione dell'RNA di ogni ceppo nei diversi momenti del procedimento sperimentale, ovvero dopo l'incubazione overnight a 37°C, dopo 30 minuti e dopo 48 di adattamento alle varie matrici di crescita. I risultati numerici di espressione genica di ogni gene sono stati normalizzati, mediati con il metodo della massima verosimiglianza ed analizzati statisticamente con ANOVA test (p < 0.05). È stata inoltre condotta un'analisi cluster previa normalizzazione su diverse condizioni ¿standard¿, al fine di evidenziare comportamenti analoghi tra geni e tra ceppi nelle diverse condizioni. Dalle analisi dei dati di espressione genica si sono potuti osservare comportamenti ceppo-dipendenti in base alla matrice di crescita ed in base al tempo di adattamento ad essa (30 minuti o 48 ore). L'estratto di salame, ad esempio, è la matrice che più ha messo in evidenza tali differenze: il ceppo #12 ha mostrato una difficoltà alla resistenza agli stress acido ed osmotico a 48 ore correlato ad un abbassamento di concentrazione di un ordine di grandezza; il ceppo EGD-e è risultato abile nel sopravvivere ma non particolarmente influenzato in termini di espressione di virulenza ed il ceppo #3, isolato in origine da una carne fermentata, ha mostrato un'ottima capacità di esprimere la maggior parte dei geni di risposta allo stress e di virulenza. Si è anche notata una buona correlazione tra l'espressione di prfA, fattore di regolazione del cluster dei geni di virulenza, e l'espressione di tali geni, anche se la pericolosità del patogeno è risultata comunque ceppo-dipendente in quanto altri geni responsabili dei primi step di colonizzazione dell'organismo ospite sono risultati espressi in modo differente. Si è notata inoltre, in linea generale, una sovra-espressione dei geni legati alla risposta allo stress osservabile già dopo 30 minuti di adattamento alla matrice di crescita, a conferma di una estrema capacità di repentini adattamenti da parte di L. monocytogenes.