APPROCCIO DI INGEGNERIA METABOLICA PER OTTENERE BATTERI LATTICI CELLULOSOLITICI

L'ingegneria metabolica è una metodologia estremamente potente ed efficace per espandere le capacità metaboliche di un microrganismo e per renderlo capace di utilizzare nuovi substrati. Essa è pertanto uno strumento molto promettente per lo sviluppo di microrganismi con le caratteristiche adeguate all'impiego in processi industriali di bioconversione di scarti o sottoprodotti di attività agricole o industriali in molecole di interesse, come carburanti o ¿building blocks¿ per la sintesi di polimeri, che ad oggi sono in maggior parte derivate da materiale fossile. Le biomasse cellulosiche sono attualmente i più abbondanti rifiuti prodotti dalle attività umane (scarti di produzioni agricole, rifiuti urbani di carta e cartone, fanghi di cartiera). Essi sono pertanto matrici rinnovabili e a basso costo il cui utilizzo nei processi di bioconversione assolverebbe il doppio ruolo di smaltimento dei rifiuti e produzione di composti utili senza il bisogno di materiali fossili. Il presente lavoro di tesi si inserisce in un progetto che ha come obiettivo lo sviluppo, mediante ingegneria metabolica, di un ceppo di L. lactis per la conversione di scarti lignocellulosici in acido lattico otticamente puro, molecola di partenza per la sintesi di polilattati (PLA). I PLA sono polimeri biodegradabili e biocompatibili che già attualmente sono utilizzati come alternativa alle plastiche di origine petrolchimica. Dato che i batteri lattici naturali non sono in grado di degradare la cellulosa, la strategia sperimentale utilizzata ha avuto come obiettivo l'espressione eterologa dei geni facenti parte del sistema cellulasico di C. cellulovorans in L.lactis IL1403. Il sistema cellulasico di C. cellulovorans comprende sia cellulosomi, complessi composti da più subunità enzimatiche organizzate intorno a una proteina scaffold che non presenta attività catalitica, sia cellulasi libere, non facenti parte integrante dei cellulosomi, ma che agiscono in sinergia con essi. Nel presente studio, i geni codificanti una forma tronca della proteina scaffold, mini-cbpA, e due cellulasi non cellulosomali, bglA ed engD, sono stati clonati nel vettore di espressione pMG36ea e introdotti in L. lactis IL1403. E' stato inoltre realizzata la costruzione ed il clonaggio in L. lactis di un minioperone artificiale bglA-engD. Le analisi eseguite hanno evidenziato che tali proteine eterologhe sono secrete nel mezzo extracellulare dai ceppi ricombinanti di L. lactis e che i ceppi trasformati con il gene per l'endoglucanasi EngD sono in grado di degradare forme solubili della cellulosa.