ESPRESSIONE ETEROLOGA IN LIEVITO DELLA PAPAIN-LIKE PROTEASE DELLA PROTEINA NSP3 DI SARS-CoV2

The last few years were deeply influenced by the pandemic caused by new Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV2). Basic research aims to understand better the biology of viral infection and how it affects humans. An important role is given to the protein NSP3 (non-structural protein 3), crucial for replication of the virus. Among multiple domains and motifs, NSP3 bears a papain-like protease (PLpro) domain, which seems to have two roles, one as protease to process the viral polyprotein, and the other to block the host immune response. To study this protein, we aimed to express it in the eukaryotic unicellular model Saccharomyces cerevisiae. Given the large size of the NSP3 protein (1944 aa), smaller constructions were designed: one lacking transmembrane segment (ΔTM), the other based just on Ubl2 and PLpro domains. We produced these truncated versions on both the wild-type and a Cys857Ala point mutation which inactivates protease activity of PLpro. Using the Gateway cloning system, fusions to fluorescent tags were made and introduced into S. cerevisiae with the purpose to study their effects in the cell and their subcellular localization. The PLpro domain, like the full-length multidomain protein, was not toxic for the yeast cell when express from our construct. However, interestingly, it localized in specific areas within the yeast cell. To be more precise, it localized in cytoplasmic spots, near the nucleus, in the neck of budding cells and in bud scars. Thus, it might interact with septins, central proteins in neck formation in budding yeast. Before cells separation, septins are SUMOylated to be degradated. PLpro has been described to affects the SUMOylation process in a way similar to the way it interacts with ubiquitin. To understand better, septins and PLpro localization was studied by fluorescence microscopy in a mutant with defects in SUMOylation. In cells deleted for the gene encoding the main SUMO ligase, Siz1, bud neck localization of PLpro was lost. In spite of this localization, PLpro did not seem to affect cell separation. Further investigations are needed to better understand whether PLpro interferes with the yeast budding cycle.

Gli ultimi anni sono stati profondamente influenzati dalla pandemia causata dal nuovo Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV2). La ricerca mira a capire meglio la biologia dell’infezione virale e come influisce sull’uomo. Un ruolo importante è attribuito alla proteina NSP3 (non-structural protein 3), fondamentale per la replicazione del virus. Tra vari domini e motivi, NSP3 contiene un dominio papain-like protease (PLpro), il quale sembra avere due ruoli, uno come proteasi che processa la poliproteina virale, l’altro per bloccare la risposta immunitaria dell’ospite. Lo studio della proteina parte dalla sua espressione nel modello eucariotico unicellulare Saccharomyces Cerevisiae. Date le grandi dimensioni della proteina NSP3 (1944 aa), sono state progettate costruzioni più piccole: una priva del segmento transmembrana (ΔTM), l’altra basata solo sui domini Ubl2 e PLpro. Abbiamo prodotto queste due versioni troncate sia in forma wild-type che con una mutazione puntiforme Cys857Ala che inattiva l’attività proteasica di PLpro. Usando il sistema di clonaggio Gateway, sono state costruite fusioni con tag fluorescenti, poi introdotte in S. Cerevisiae con l’obiettivo di studiare i loro effetti all’interno della cellula e la loro localizzazione subcellulare. Il dominio PLpro, come l’intera proteina, non sono risultate tossiche per le cellule di lievito una volta espresse. È stato osservato che il dominio PLpro si localizzava in aree specifiche nella cellula di lievito. Per essere precisi, si è localizzata in punti citoplasmatici, vicino al nucleo, nel collo delle cellule in gemmazione e nelle cicatrici dovute alla gemmazione. Dunque, si pensa possa interagire con le septine, proteine fondamentali nella formazione del collo nei lieviti in gemmazione. Prima della separazione delle cellule, le septine sono SUMOilate per essere degradate. È stato proposto che PLpro influenzi il processo di SUMOilazione in una maniera similare a quella con cui interagisce con l’ubiquitina. Per comprendere meglio, PLpro e le septine sono state colocalizzate con microscopia a fluorescenza sia in forma wild-type che in un mutante con difetti nella SUMOilazione. Nelle cellule in cui è stato eliminato il gene che codifica per l’enzima responsabile della SUMOilazione, Siz1, PLpro non si localizza più nel collo. Nonostante la localizzazione, PLpro non sembra aver influito sulla separazione delle cellule. Sono necessarie più approfondite indagini per comprendere come PLpro interagisca con il ciclo di gemmazione dei lieviti.