Attività biologica di nuovi inibitori dell’attivazione dell’inflammasoma NLRP3

The inflammasome is a cytosolic macromolecular protein complex that coordinates host immune responses to invading pathogens and host-derived danger signals. Its formation is initiated by the Pattern Recognition Receptors, of which have been identified several families responding to different stimuli (1). The NLRP3 inflammasome is a critical component of the innate immune system and it mediates caspase-1 activation, which cleaves gasdermin D, allowing its N-terminal domain to form pores in the plasma membrane, and thereby triggering swelling and cell lysis; this pro-inflammatory form of cell death is called pyroptosis. Furthermore, through a proteolytic process of maturation, it transforms the pro-IL-1β and pro-IL-18 cytokines into their biologically active forms, secreted by the cell (2). Inflammasome pathways are strictly regulated at both transcriptional and post-translational checkpoints and the undue inflammasome activation may promote inflammatory, metabolic and oncogenic processes, which give rise to autoinflammatory, autoimmune, metabolic and malignant diseases. Currently, in addition to biologics targeting IL-1β clinically approved to treat specific diseases associated with NLRP3, upstream targeting of inflammasome pathways recently gained interest as a new pharmacological strategy for selectively modulating inflammasome activation in pathological conditions (3). The aim of the thesis was to study the ability of newly synthesized compounds to inhibit the NLRP3 inflammasome activation. In particular the anti-pyroptotic activity of these compounds at 10µM concentration was studied on THP-1 cells, differentiated with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) in which the NLRP3 inflammasome was activated by two stimuli, lipopolysaccharide and ATP, evaluating the cytosolic released of lactate dehydrogenase through the CitoTox 96® Non Radioactive Citotoxicity Assay. Furthermore, the ability of these compounds to modulate IL-1β release was evaluated by means of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Finally, using the MTT assay (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), the citotoxic effect of the compounds was determined at 72 hours of incubation. The data obtained show that some compounds are promising inhibitors of the inflammasome activation, with an anti-pyroptotic effect accompanied by a reduction in the levels of IL-1β. The compounds used have a cytotoxic effect only at concentrations higher than the one used to inhibit the inflammasome activation. In the future, the ability of these compounds to inhibit the inflammasome activation using other stimuli, such as nigericin and monosodium urate, and their ability to inhibit the activation of caspase-1 will be tested.

L'inflammasoma è un complesso proteico macromolecolare citosolico che coordina le risposte immunitarie dell'ospite in risposta a patogeni invasori e a segnali di pericolo derivanti dall'ospite stesso. La sua formazione viene indotta attraverso i Pattern Recognition Receptor, di cui sono state individuate diverse famiglie che rispondono a diversi stimoli (1). L'inflammasoma NLRP3 rappresenta un componente critico del sistema immunitario innato e media l'attivazione della caspasi-1 che scinde la gasdermina D, consentendo al suo dominio N-terminale di formare dei pori nella membrana cellulare, causando rigonfiamento e lisi cellulare; questa forma infiammatoria di morte cellulare è chiamata piroptosi. Inoltre, attraverso un processo proteolitico di maturazione, trasforma le citochine pro-IL-1β e pro-IL-18 nelle loro forme biologicamente attive, secrete dalla cellula (2). Le vie dell'inflammasoma sono strettamente regolate sia a livello trascrizionale che post-trasduzionale e l'attivazione indebita dell'inflammasoma può promuovere processi infiammatori, metabolici e oncogeni che danno origine a malattie autoinfiammatorie, autoimmuni, metaboliche e tumorali. Attualmente oltre ai farmaci biologici mirati all'interleuchina-1β clinicamente approvati per trattare alcune malattie associate a NLRP3, ha destato interesse il targeting a monte dell'inflammasoma come nuova strategia farmacologica per modulare selettivamente l'attivazione dell'inflammasoma in condizioni patologiche (3). Lo scopo della tesi è stato quello di studiare la capacità di inibire l’attivazione dell'inflammasoma NLRP3 da parte di composti di nuova sintesi. In particolare, è stata studiata l’attività antipiroptotica di questi composti alla concentrazione 10M, su cellule THP-1, differenziate con forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA), in cui l’inflammasoma NLRP3 è stato attivato mediante due stimoli, il lipopolisaccaride e l’ATP, valutando il rilascio citosolico di lattato deidrogenasi attraverso il saggio CitoTox 96® Non Radioactive Citotoxicity Assay. Inoltre, è stata valutata la capacità di questi composti di modulare il rilascio di IL-1β, attraverso il saggio immuno-assorbente legato ad un enzima (ELISA). Infine, utilizzando il saggio MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) è stato determinato l’effetto citotossico dei composti a 72 ore di incubazione. I dati ottenuti evidenziano come alcuni composti siano promettenti inibitori dell’attivazione dell’inflammasoma, con effetto antipiroptotico accompagnato da una riduzione dei livelli di IL-1β. I composti utilizzati hanno un effetto citotossico solo a concentrazioni superiori a quella utilizzata per inibire l’attivazione dell’inflammasoma. In futuro, si testerà la capacità di questi composti di inibire l’attivazione dell’inflammasoma utilizzando altri stimoli, come il sodio monurato e la nigericina e la loro capacità di inibire l’attivazione della caspasi-1. 1) Kelley N; Jeltema D; Duan Y; He Y. The NLRP3 Inflammasome: An Overview of Mechanisms of Activation and Regulation. Iternational Journal of Molecular Sciences. 2019; 20(13); 3328 2) Swanson KV; Deng M; Ting JP. The NLRP3 inflammasome: molecular activation and regulation to therapeutics. Nature reviews. Immunology. 2019; 19(8); 477-489. 3) Chauhan D; Vande Walle L; Lamkanfi M. Therapeutic modulation of inflammasome pathways. Immunological reviews. 2020; 297(1); 123-138.