Knock-out di MYB12 in Solanum lycopersicum L.: confronto tra gli approcci CRISPR/Cas9 e Cpf1

The new plant breeding technologies play a fundamental role in the possible improvement of agricultural production, in the light of the exponential growth of the world population and of the ever more extreme climatic changes. In this panorama, the need to modify agronomic features of interest in crops is acquiring an increasingly central function, in order to maximize nutraceutical properties, the quantity or quality of fruits and the resistance to biotic and abiotic stresses. In 2013, a genetic improvement methodology CRISPR (Clustered Regularly Interspected Short Palindromic Repeats) associated with a nuclease system was discovered. It is based on the use of a guide RNA (gRNA) that directs a known endonuclease, in a specific target site, to induce a cleavage. In addition to CRISPR-Cas9, a second promising Cpf1 endonuclease has emerged in the last two years. In my thesis I compared the ability of Cas9 and Cpf1 to induce a mutation in the MYB12 gene, in a Valencian tomato variety (Muchamiel). MYB12 is a transcription factor of type R2R3-MYB, with an important role in the regulation of flavonoid synthesis. The transformation constructs were assembled using the "Golden Braid" system. The editing of MYB12 was designed by drawing two gRNAs at a distance of about 1700 bp, to induce a massive gene deletion. Three different vectors were created, having in common the NptII selection marker for kanamycin resistance, but different gRNAs for the respective endonucleases used: Cas9, AsCpf1 and LbCpf1. The CRISPR / Cas9_AsCpf1_LbCpf1 constructs were transformed into a plant using A. tumefaciens strain LBA4404 and infecting plant extracts from "Muchamiel" seedlings grown in vitro. In about three months regenerated plantlets were obtained, from these was possible to extract the DNA of the first leaves to perform genotyping analysis on the target regions of MYB12. The efficiency of transformation obtained (by 10%) is in line with that found in several gene editing jobs conducted in tomato. Specifically, starting from 50 cotyledons transformed by construct, we observed a greater number of regenerated seedlings for the AsCpf1 construct with 12 individuals, while for Cas9 and LbCpf1 the numbers are lower, respectively 8 and 7. To verify the successful insertion of the construct in the tomato genome, amplifications were performed on Cas9 and alternatively on NptII. The verification of the attempted deletion was performed through PCR analysis, but since it proved to be ineffective, the presence of indels on the individual regions of the two gRNAs was assessed for each transformation event. To examine the editing events, T7 enzymatic assays were performed and Sanger sequencing was performed on the positive samples. The results obtained are interesting and promising. The main mutations observed are insertions of a single base or deletions of 3 or 6 nucleotides. The efficiency results between the two CRISPR systems are around 70% slightly higher for Cpf1. On these rooted regenerated plants it was not possible to observe the expected mutated phenotypes, due to the necessary time of growth and the exploitation of the single transformed individuals. These changed plants, following an appropriate phase of acclimatization in the greenhouse, should present the classic "pink fruits" phenotype.

Le nuove tecnologie di selezione vegetale svolgono un ruolo fondamentale nel possibile miglioramento della produzione agricola, alla luce della crescita esponenziale della popolazione mondiale e degli imminenti cambiamenti climatici sempre più estremi. In questo panorama, la necessità di modificare tratti agronomici d'interesse nelle colture sta acquisendo una funzione sempre più centrale, al fine di massimizzare le proprietà nutraceutiche, la quantità o la qualità dei frutti e la resistenza agli stress biotici ed abiotici. Nel 2013, è stato scoperto una metodologia di miglioramento genetico CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) associato ad un sistema di nucleasi. Si basa sull'utilizzo di un RNA guida (gRNA) che dirige un'endonucleasi nota, in un sito targetvspecifico, per indurvi un taglio. Oltre a CRISPR-Cas9, negli ultimi due anni è emersa una seconda promettente endonucleasi Cpf1. Nella mia tesi ho confrontato la capacità di Cas9 e Cpf1 di indurre una mutazione nel gene MYB12, in una varietà valenciana di pomodoro (Muchamiel). MYB12 è un fattore di trascrizione di tipo R2R3-MYB, con un ruolo importante nella regolazione della sintesi dei flavonoidi. I costrutti di trasformazione sono stati assemblati utilizzando il sistema "Golden Braid". L'editing di MYB12 è stato ideato disegnando due gRNA ad una distanza di circa 1700 bp, per indurre una massiccia delezione genica. Sono stati realizzati 3 diversi vettori, aventi in comune il marker di selezione NptII per la resistenza alla kanamicina, ma diversi gRNA per le rispettive endonucleasi adoperate: Cas9, AsCpf1 e LbCpf1. I costrutti CRISPR/Cas9_AsCpf1_LbCpf1 sono stati trasformati in pianta utilizzando A. tumefaciens ceppo LBA4404 e infettando espianti di foglie di piantine di ¿Muchamiel¿ cresciute in vitro. In circa tre mesi sono state ottenute delle plantule rigenerate, dalle quali si è potuto estrarre il DNA delle prime foglie per eseguire analisi di genotyping sulle regioni target di MYB12. L'efficienza di trasformazione ottenuta (del 10 %) è in linea con quella rilevata in diversi lavori di gene editing condotti in pomodoro. Nello specifico a partire da 50 cotiledoni trasformati per costrutto, si è osservato un numero maggiore di piantine rigenerate per il costrutto AsCpf1 con 12 individui, mentre per Cas9 e LbCpf1 i numeri sono più bassi, rispettivamente 8 e 7. Per verificare l'avvenuta inserzione del costrutto nel genoma di pomodoro, sono state condotte amplificazioni su Cas9 e in alternativa su NptII. La verifica della tentata delezione è stata effettuata attraverso analisi PCR, ma poiché è risultata essere inefficace, si è valutata la presenza di indels sulle singole regioni dei due gRNA per ogni evento di trasformazione. Per esaminare gli eventi di editing, sono stati effettuati saggi enzimatici T7 e sui campioni positivi è stato eseguito un sequenziamento Sanger. I risultati ottenuti sono interessanti e promettenti. Le principali mutazioni osservate sono inserzioni di una singola base o delezioni di 3 o 6 nucleotidi. I risultati di efficienza tra i due sistemi CRISPR sono attorno al 70% leggermente superiori per Cpf1. Su queste piantine rigenerate radicate non è stato possibile osservare i fenotipi mutati attesi, a causa del tempo necessario di crescita e della messa a frutto dei singoli individui trasformati. Tali piante mutate, a seguito di un'opportuna fase di acclimatazione in serra, dovrebbero presentare il classico fenotipo ¿frutti rosa¿.