Stima dei parametri analitici per la genotipizzazione probabilistica di STR di uso forense mediante SeqStudio Genetic Analyzer

Interpretation guidelines of short tandem repeat (STR) polymorphisms used in human forensic identification and kinship testing need to take into account stochastic events (allele drop out and drop in) that can occur in the amplification of low template DNA. Internal validation of STR testing kits is therefore necessary and must be renovated whenever a new amplification or DNA typing platform is introduced in the laboratory. In this study, four different STR typing kits (AmpFlSTR Identifiler Plus, Investigator ESSplex SE QS, PowerPlex ESI 17 and PowerPlex ESX 17) routinely used in casework at the Forensic Genetics Unit of the Institute of Legal Medicine of the University of Turin were evaluated in combination with the recently acquired multicapillary electrophoresis system SeqStudio genetic analyzer. Using a series of PCR blanks, analytical threshold (AT), probability of drop out and a lambda parameter connecting peak height with a priori probability for a peak of being a drop in were calculated. A higher baseline noise in the PET red dye-channel (requiring a 100 rfu AT, compared to a 50 rfu standard value for other dye channels/kits) was observed for AmpFlSTR Identifiler Plus. The same kit also displayed higher peak height in drop in events, leading to a decidedly smaller value of lambda (which is inversely proportional to a priori probability of drop in), compared to other kits. Probability of drop out was determined through logistic regression using dilution series of control DNA samples with known genotype. It could be seen that the risk of drop out events was overly reduced (≤ 5%) in all kits in a range of peak height between 400-500 rfu which was, however, superior to the cautionary value indicated by SeqStudio manufacturers (175 rfu). The 5% stochastic threshold was even higher (~700 rfu) for the PowerPlex ESX 17 kit. The calculated parameters were included in laboratory standard operative procedures for the interpretation of probabilistic genotyping results. Their impact was demonstrated through two explanatory examples selected from casework (paternity testing from skeletal remains with likely drop out events, LT-DNA typing from a contact stain with possible drop in events).

Le linee guida per l'interpretazione dei polimorfismi STR (short tandem repeat) usati nell'identificazione forense umana e nei test di parentela devono tenere conto degli eventi stocastici (drop out e drop in allelici) che possono verificarsi nell'amplificazione di campioni a basso contenuto di DNA. La validazione interna dei kit di analisi STR è quindi necessaria e deve essere rinnovata ogni volta che viene introdotta in laboratorio una nuova piattaforma di amplificazione o di tipizzazione del DNA. In questo studio, quattro diversi kit di tipizzazione STR (AmpFlSTR Identifiler Plus, Investigator ESSplex SE QS, PowerPlex ESI 17 e PowerPlex ESX 17) usati abitualmente nella casistica di laboratorio presso la sezione di Genetica Forense dell'Istituto di Medicina Legale dell'Università di Torino sono stati valutati in combinazione con il sistema di elettroforesi multicapillare SeqStudio, recentemente acquisito dal laboratorio. Utilizzando una serie di negativi di PCR, sono stati calcolati la soglia analitica (AT), la probabilità di drop out e un parametro lambda che collega l'altezza del picco con la probabilità a priori per un picco di essere un drop in. Per l'AmpFlSTR Identifiler Plus è stato osservato un rumore di fondo più elevato nel canale del fluorescente rosso PET (che richiede un AT di 100 rfu, rispetto a un valore standard di 50 rfu per altri fluorescenti/kit). Lo stesso kit ha anche mostrato tendenzialmente una maggiore altezza dei picchi negli eventi di drop in, portando ad un valore decisamente più piccolo di lambda (che è inversamente proporzionale alla probabilità a priori di drop in), rispetto ad altri kit. La probabilità di drop out è stata determinata tramite regressione logistica utilizzando serie di diluizioni di campioni di DNA di controllo con genotipo noto. Si è potuto constatare che il rischio di eventi di drop out era decisamente ridotto (≤ 5%) in tutti i kit in un intervallo di altezza del picco compreso tra 400-500 rfu, un valore comunque superiore a quello cautelativo indicato dai produttori di SeqStudio (175 rfu). La soglia stocastica del 5% era ancora più alta (~700 rfu) per il kit PowerPlex ESX 17. I parametri calcolati sono stati inclusi nelle procedure operative standard del laboratorio per l'interpretazione dei risultati di genotipizzazione probabilistica. Il loro impatto è stato dimostrato attraverso due esempi esplicativi selezionati tra i casi di laboratorio (test di paternità da resti scheletrici con verosimili eventi di drop out, tipizzazione LT-DNA da una traccia da contatto con possibili eventi di drop in).