RNA intereference: applicazioni pratiche in campo entomologico

RNA interference (RNAi) refers to a suppression mechanism of gene expression, highly conserved among eukaryotes, mediated by double stranded RNAs (dsRNA). The overall molecular mechanism can be divided into three basic steps: during the initial step (1) a long dsRNA introduced into the cell is digested into small double strand fragments called small interfering RNAs (siRNA), by the enzyme DICER. During the effector step (2) siRNA fragments are incorporated into the multi-protein RNA induced silencing complex (RISC) where the double strand is denatured. Now one single strand is able to pair mRNAs containing specific complementary sequences and a catalytic component of RISC, the Argonaute protein, cleaves mRNA target. Translation of all complementary mRNAs is blocked. During the amplification step (3) RNA-polymerase spreads interference's signal to other cells. RNAi offers great opportunities for studies about functional genomic as well as for practical applications in entomology. This technology, for example, has been used to control the bloodsucking bug Rhodnius prolixus (Stål), an important vector of Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease. The natural symbiont, Rhodococcus rhodnii, transformed to express dsRNA targeting CAT and RHBP genes, coding for antioxidant proteins, has been introduced in insect's body by ingestion in order to induce a systemic RNAi. This experiment represents the first success to control dangerous insects for human health. Recently RNAi has been employed to control pest populations in agriculture. For example transgenic maize plants expressing dsRNA targeting western corn root-worm (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) vacuolar ATPase (V-ATPase) subunit A, or C, provided significant root protection from WCR larval feeding damage. RNAi turned out also an efficient technology to manage western flower thrips Frankliniella occidentalis (Pergande). Using a microinjection system dsRNA molecules, targeting the V-ATPase subunit B, had been delivered directly to the hemocoel of thrips. The fall in V-ATPase-B expression resulted in increased mortality and reduced fertility. Finally, in entomology, RNAi technology has been used successfully to protect honey bee (Apis mellifera, Linneo) from pathogens or parasites. The first dsRNA product, Ramebee® has been tested as a valid laboratory and field instrument to reduce infection by the Israeli Acute Paralysis Virus (IAPV), associated with declining bee colonies. A recent study has also showed that dsRNA ingested by bees is transferred to the Varroa destructor (Anderson & Trueman) mite, an obligatory ectoparasite of the honey bee, and from mite on to a parasitized bee, demonstrating a new approach to V. destructor control. The major challenges of a large-scale application of RNAi are played by identifying specific target genes and delivery methods. Although these problems, owing to the development of resistance against many types of chemical insecticides, RNAi technology represents today a valid alternative to chemical control.

Il termine inglese ¿RNA interference¿ (RNAi) fa riferimento ad un meccanismo di silenziamento dell'espressione genica, altamente conservato negli eucarioti, mediato da molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA). Il meccanismo molecolare prevede tre fasi: durante la fase di inizio (1) una lunga molecola di dsRNA è introdotta nella cellula e un enzima chiamato DICER la digerisce in piccole strutture di RNA a doppia elica, i così detti ¿small interfering RNA¿ (siRNA). Durante la fase effettrice (2) le molecole di siRNA vengono incorporate in un complesso enzimatico chiamato RISC che denatura la doppia elica e l'RNA a singolo filamento che si forma è quindi in grado di ibridarsi con l'mRNA target endogeno inducendo l'azione di una componente del RISC, detta Argo, che opera un taglio sull'mRNA. Tutti gli mRNA complementari si appaieranno all'RNA a singolo filamento e verranno pertanto degradati e inattivati. Durante la fase di amplificazione (3) una RNA-polimerasi propaga il segnale di interferenza a tutto l'organismo. L'RNAi ha enormi potenzialità in campo entomologico non solo per studi di genomica funzionale ma anche per applicazioni pratiche. Infatti la tecnologia è stata impiegata con successo per il contenimento della cimice Rhodnius prolixus (Stål), vettore di Trypanosoma cruzi, l'agente eziologico della malattia di Chagas. Il simbionte naturale dell'insetto, Rhodococcus rhodnii, modificato geneticamente per esprimere dsRNA diretto contro i geni CAT e RHBP, codificanti per proteine antiossidanti, è stato introdotto nel corpo dell'insetto tramite ingestione. L'induzione di una sistemica RNAi ha rappresentato il primo successo di impiego della tecnologia per controllare insetti di interesse medico. Recentemente l'RNAi si è rivelata molto utile per il contenimento di insetti dannosi per l'agricoltura. Per esempio piante di mais transgeniche esprimenti molecole di dsRNA dirette contro la subunità A o C della ATPasi vacuolare (V-ATPasi) di Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) sono risultate resistenti ai danni causati dalle larve di questo coleottero. Inoltre l'RNAi si è dimostrata utile per il controllo del tripide Frankliniella occidentalis (Pergande). Le molecole di dsRNA, dirette contro il gene della subunità B della V-ATPasi, sono state introdotte nell'emocele dell'insetto attraverso un sistema di microiniezione e la conseguente riduzione dell'espressione genica ha causato una diminuzione della fertilità e un incremento della mortalità del tripide. Infine l'RNAi si è rivelata un valido strumento per la protezione dell'ape da patogeni e parassiti. L'efficacia del Ramebee®, il primo prodotto a base di dsRNA, nel ridurre le infezioni del Virus della Paralisi Acuta (IAPV) nell' Apis mellifera (Linnaeus), è stata saggiata sia in laboratorio che in campo. Inoltre un recente studio ha messo in luce un trasporto bidirezionale di dsRNA tra ape e Varroa destructor (Anderson & Trueman), un piccolo acaro ectoparassita, suggerendo un nuovo approccio basato sull'RNAi per il controllo del parassita. Nonostante vi siano ancora alcune criticità all'applicazione su larga scala dell'RNAi, tra cui la corretta scelta del gene target e del metodo di distribuzione, la tecnologia risulta una valida alternativa all'attuale lotta chimica la cui efficacia risulta oggi compromessa dallo sviluppo di resistenza da parte degli artropodi nei confronti degli insetticidi chimici.