Pathway cardioprotettivo della Neuregulina in un modello cellulare di ischemia/riperfusione

Lo scopo di questo progetto di tesi è stato investigare il ruolo cardioprotettivo del peptide neuregulina (Nrg1β1) in condizioni ischemiche in un modello semplificato di cellula cardiaca. Nrg1β1 è implicato in alcuni processi fisiologici e patologici ed è espresso in differenti tessuti incluso quello cardiaco e in particolare è espresso nel tessuto endoteliale endocardico in prossimità dei cardiomiociti. Nel cuore adulto Nrg1β1 lega i recettori ErbB4 che possono creare eterodimeri con il co-recettore ErbB2, entrambi espressi nei cardiomiociti. Recentemente l'asse Nrg1-ErbB è stato proposto come un'importante via cardioprotettiva per il trattamento del danno al miocardio da ischemia/riperfusione (I/R). Durante l'evento di I/R si verifica un aumento del Ca2+ citosolico risultante da un'inversione dello scambiatore Na+/Ca2+ e l'accumulo di Ca2+ è soggetto ad un ulteriore influsso di Ca2+ causato da una disfunzione del reticolo sarcoplasmatico mediato da specie reattive dell'ossigeno. Questi eventi concorrono all'apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTP), causando la distruzione della membrana interna mitocondriale, seguita della rottura della membrana esterna con il rilascio di proteine come il citocromo c, coinvolto nella morte cellulare. Nrg1β1 può indirettamente regolare l'apertura degli mPTP all'inizio della riperfusione attraverso la sua azione sul re-uptake del calcio intracellulare, evitando in questo modo l'accumulo di questo ione e perciò il danno mitocondriale. La nostra attenzione è stata indirizzata sugli effetti della Nrg1β1 studiando alcuni delle vie di segnalazione che essa attiva. Questi pathway molecolari coinvolgono la fosforilazione di Akt (PAktSer473) componente della via RISK, importante nella cardioprotezione; la fosforilazione di PLN (PPLNSer16 and PPLNThr17) importante nel re-uptake del Ca2+ grazie ad un aumento dell'attività di SERCA, e la fosforilazione di GSK3 β (PGSK3 βSer9) coinvolta nell' inibizione dell'apertura degli mPTP. In particolare sono stati allestiti esperimenti di immunofluorescenza per investigare i livelli di fosforilazione durante I/R simulata al termine di alcuni trattamenti. Abbiamo rilevato un significativo aumento della fosforilazione di ciascuna di queste molecole in seguito a somministrazione di Nrg1β se confrontato con il trattamento con gli inibitori e con I/R da sola. Successivamente abbiamo studiato la conservazione dell'attività mitocondriale e la stabilità del potenziale mitocondriale in cardiomiociti vivi attraverso la sonda JC-1. E'stato riscontrato che in seguito a trattamento con Nrg1β1 la permeabilità mitocondriale non è cambiata e questo si è riflettuto sul mantenimento dell'integrità mitocondriale e sulla sopravvivenza cellulare. In conclusione questi esperimenti affermano l'importante ruolo della Nrg1β1 nella cardioprotezione contro l'ischemia.

The aim of this thesis project was to investigate the cardioprotective role of Neuregulin peptide (Nrg1β1) in ischemic conditions in a simplified cardiac cell model. Nrg1β1 is implicated in some physiological and pathological processes and it is expressed in different tissues including the cardiac tissue where Nrg1β1 is expressed in the endocardial endothelium near cardiomyocytes. In the adult heart Nrg1β1 binds ErbB4 receptors that can create heterodimers with co-receptor ErbB2, both expressed in the cardiomyocytes. Recently, Nrg-1/ErbB axis has been proposed as an important cardio-protective pathway for the treatment of myocardial ischemia/reperfusion (I/R) damage. During I/R event an increase in cytosolic Ca2+ occurs as the result of the reverse function of Na+/Ca2+ exchanger and the Ca2+ overload is subject to a further influx of Ca2+ caused by sarcoplasmic reticulum dysfunction mediated by reactive oxygen species. All these events concur in mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, resulting in internal mitochondrial membrane disruption, followed by mitochondrial membrane rupture with the release of proteins like cytochrome c involved in cell death. Nrg1β1 might indirectly regulate mPTP opening at the onset of reperfusion through its action on intracellular Ca2+ handling thereby avoiding detrimental intracellular Ca2+ overload development and mitochondrial impairment. We direct our attention to the Nrg1β1 effects studying some of its molecular pathways that involve Akt phosphorylation (PAktSer473) part of the RISK pathway, important in the cardioprotection; PLN phosphorylation (PPLNSer16 and PPLNThr17) important to Ca2+ reuptake by increase SERCA activity; GSK3 β phosphorylation (PGSK3 βSer9) implicated in the inhibition of mPTP opening. In particular we performed immunofluorescence experiments to investigate phosphorylation level during simulation I/R, after different treatments. We found a significant increase in each of these phosphorylated molecules after Nrg1β1 administration compared to I/R alone and inhibitors treatments. We also studied the preservation of mitochondrial activity and mitochondrial potential stability on living cardiomyocytes through JC-1 probe. We found that after Nrg1β1 treatment the mitochondrial permeability did not change and this resulted in mitochondrial integrity and cell survival. In conclusion these experiments reassert the important role of Nrg1β1 in the cardioprotection against ischemia.