IL SISTEMA CRISPR/Cas9 COME VALIDO STRUMENTO DI GENOME EDITING APPLICABILE AI LIEVITI ENOLOGICI

The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs) are segments containing short repeated sequences separated by short DNA fragments generated by exposure of the bacterium to bacteriophages or plasmids and CRISPR-associated (Cas) is a complex of CRISPR associated genes that is able to encode for proteins to cutting DNA. The CRISPR/Cas9 system requires an endonuclease (Cas9) that is guided to a specific DNA sequence by a guide RNA (gRNA). The assembling of a ribonucleoprotein complex (Cas9/gRNA) can produce cuts in specific sites of eukaryotic genomes. CRISPR/Cas9 is gaining significant attention because of its biotechnological applications and its potential to boost innovation. The CRISPR/Cas9 can be applied to introduce either single point mutations or large deletions/insertions of nucleotide sequences in many eukaryotic organisms, including the model yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular studies should help understanding the contribution of Saccharomyces and non-Saccharomyces species to several wine features such as those linked to wine quality and safety. To prove the robustness of this system and to offers an engineering pipeline for further gene editing in specific metabolic pathways relevant for the wine production, two commercial strains of S. cerevisiae (EC1118, AWRI796) have been genetically engineered in the arginine degradation pathway to generate strains with a reduced urea production. Urea can be released by wine yeasts as metabolic intermediate from arginine breakdown (König et al. 2009). Arginine, transported into the cell through specific and/or general amino acid permeases (encoded by CAN1 and GAP1 genes, respectively) is cleaved by arginase (CAR1 gene) into ornithine and urea. Urea can be excreted trough Dur4p, a passive urea permease, or transformed in ammonium and carbon dioxide by Dur1p/Dur2p, two urea amidolyases. Urea is considered the major precursor for ethyl carbamate (EC) in wine (Ough et al. 1988). EC can be formed as a consequence of a spontaneous, non-enzymatic, reaction between ethanol and a compound containing a carbamyl group, such as urea. EC is a toxic compound recognised as genotoxic and carcinogenic in a number of mammalian species. It affects several fermented foods and, in wines, EC is usually found in significant amounts (10-25 µg/L). Considering that many countries have introduced a specific regulation for EC limits, the development of actions that prevent and/or reduce its content in wine represents an important goal in wine industry. In a chemically defined medium with arginine as sole nitrogen source, recombinant strains carrying the mutation in CAN1 gene show a decrease in urea production between 11-17% for S.cEC1118 and S.cAWRI796, respectively. In a wine-model constituted by two grape musts obtained from Chardonnay and Cabernet Sauvignon cultivars, S. cerevisiae wild type and its CAN1 mutant completed the must fermentation in 8-10 days; the recombinant strains carrying the mutation in CAN1 gene failed to produce urea suggesting that the genetic modification successfully impair the arginine metabolism. In conclusion, the reduction of urea production in a laboratory and in a wine-model environment confirms that the CRISPR/Cas9 system has been successfully established in S. cerevisiae wine yeasts.

I CRISPRs (brevi ripetizioni palindrome raggruppate e spaziate con regolarità) sono segmenti di DNA contenenti brevi sequenze ripetute e distanziate da frammenti di DNA generati dall'esposizione del batterio a batteriofagi o plasmidi, il Cas (Crispr-associated) è un complesso di geni associati al CRISPR e in grado di codificare per proteine che tagliano il DNA. Il sistema richiede una endonucleasi (Cas9) che viene guidata ad una specifica sequenza di DNA da un RNA guida (gRNA). Il complesso ribonucleoproteico (Cas9/gRNA) è in grado di produrre tagli in siti specifici di genomi eucariotici. Il sistema CRISPR/Cas9 sta generando grande attenzione sul panorama scientifico per le sue possibili applicazioni in ambito biotecnologico e per le sue potenzialità innovative. Il sistema CRISPR/Cas9 può essere applicato per introdurre sia mutazioni puntiformi che delezioni o inserzioni di sequenze nucleotidiche in molti organismi eucarioti, compreso il lievito modello Saccharomyces cerevisiae. Studi molecolari potrebbero aiutare a comprendere il contributo delle specie Saccharomyces e non-Saccharomyces a diverse caratteristiche del vino, come quelle legate alla qualità e alla sicurezza. Per dimostrare l'efficacia di questo sistema e offrire una linea guida per ulteriori modifiche geniche in vie metaboliche specifiche dei lieviti enologici, due ceppi commerciali di S. cerevisiae, EC1118 e AWRI796, sono stati geneticamente modificati nella via di degradazione dell'arginina per generare ceppi con ridotta produzione di urea. L'urea può essere escreta dal lievito nel vino come intermedio metabolico della via di degradazione dell'arginina. L'arginina, principale amminoacido del vino, trasportata nella cellula attraverso permeasi specifiche, codificate dai geni CAN1 e GAP1, viene scissa dall'enzima arginasi (codificata dal gene CAR1) in ornitina ed urea. L'urea può essere escreta nel mezzo attraverso Dur4p, una permeasi passiva dell'urea o essere trasformata in ammonio e anidride carbonica da Dur1p/Dur2p, due amidolasi dell'urea. L'urea è considerata il principale precursore del carbammato di etile (EC) nel vino, il quale si può formare da una reazione spontanea e non enzimatica tra etanolo e un composto contenente un gruppo carbamilico, come l'urea. L'etilcarbammato è un composto riconosciuto genotossico e potenziale cancerogeno in un certo numero di specie di mammiferi, tra cui l'uomo (IARC). È presente in diversi alimenti fermentati, tra i quali il vino, in quantità significative (10-25 µg/L). Molti paesi hanno introdotto una specifica regolamentazione riguardo ai limiti in µg/L di Etilcarbammato accettabili negli alimenti, da qui lo sviluppo di azioni dell'industria enologica che impediscano e che siano mirate a ridurne il contenuto nel vino. In un mezzo chimicamente definito con arginina come unica fonte di azoto, ceppi mutati nel gene CAN1, mostrano una diminuzione della produzione di urea dell'11 e 17% rispettivamente per S.cEC1118 e S.cAWRI796. In due mosti modello (Chardonnay e Cabernet Sauvignon) S. cerevisiae wild type e il suo mutante CAN1 completano la fermentazione del mosto in 8-10 giorni; i mutanti CAN1 non producono urea suggerendo che la modificazione genetica compromette con successo il metabolismo dell'arginina. In conclusione, la riduzione della produzione di urea in un mezzo chimico da laboratorio e in due vino modello conferma che il sistema CRISPR/Cas9 si è stabilito con successo nei lieviti enologici della specie S. cerevisiae.