Messa a punto e applicazione del metodo Propidio Monoazide-Real time PCR per la ricerca di Legionella pneumophila in campioni d'acqua

Ogni anno in tutto il mondo sono segnalate diverse epidemie causate da acqua contaminata, queste sono determinate da diversi microrganismi, tra cui Legionella spp.. Questo microrganismo è causa di due patologie: la legionellosi, che è una grave forma di polmonite per la quale esiste l'obbligo di notifica, e la febbre di Pontiac che si presenta con sintomi simil influenzali. Le Linee guida nazionali ed internazionali richiedono l'utilizzo della sorveglianza ambientale per monitorare gli impianti idrici al fine di ridurre il rischio di contrarre la malattia. Il metodo più utilizzato per la sorveglianza ambientale di Legionella spp. è il metodo colturale che presenta alcune criticità. Alla metodica colturale si può affiancare la metodica molecolare Real time PCR che consente di identificare e quantificare Legionella spp. in unità genomiche per litro di campione in poche ore. Anche la PCR presenta alcuni inconvenienti: lo svantaggio più rilevante è l'incapacità di distinguere il DNA proveniente da cellule vive da quello proveniente da cellule morte. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di mettere a punto un metodo molecolare quantitativo (Real-time PCR) in grado di evidenziare solo i microrganismi vivi attraverso l'uso dell'intercalante al DNA Propidio Monoazide (PMA). La metodica è stata applicata prima su colture pure di L. pneumophila, al fine di individuare la concentrazione ottimale di PMA e il migliore metodo di esposizione (filtro/liquido) e poi su 70 campioni reali provenienti da una struttura turistico recettiva. I risultati delle prove effettuate utilizzando diverse concentrazioni di PMA hanno evidenziato che la concentrazione 25 µM di PMA è risultata essere la più efficace nell'abbattere il segnale delle cellule morte senza indurre un effetto tossico sulle cellule vive, sia per l'esposizione su filtro che in liquido. Dal confronto tra l'esposizione al PMA direttamente sul filtro e in fase liquida i risultati ottenuti hanno evidenziato che la metodica di esposizione al PMA sul filtro permette di ottenere risultati migliori soprattutto a concentrazioni basse di legionelle confermando il possibile utilizzo di questa metodica anche per l'analisi di campioni d'acqua poco contaminati. I risultati ottenuti sui campioni ambientali provenienti da una struttura turistico recettiva, sottoposti al trattamento di disinfezione con acido ipocloroso hanno evidenziato che, in generale, il metodo PMA-Real time PCR è stato in grado di abbattere il segnale emesso dal DNA delle cellule morte e di evidenziare il segnale dovuto alla presenza di cellule VBNC. Solo in alcuni casi la PMA-Real time PCR ha dato esito negativo a fronte di un'analisi colturale positiva; le concentrazioni riscontrate erano però al di sotto dei 2 Log UFC/L, e in alcuni casi anche al di sotto di 1 Log UFC/L, livelli ai quali non sono richieste particolari misure preventive; quindi l'assenza di segnale legata all'applicazione del PMA non dovrebbe costituire un fattore di rischio per l'esposizione al microrganismo. Per quanto riguarda l'aspetto igienico sanitario il livello di contaminazione riscontrato nei campioni ambientali analizzati mette in evidenza la diffusione di questa problematica e la necessità di una continua sorveglianza sia epidemiologica che ambientale; quindi sarebbe molto efficace poter disporre di un metodo rapido e sensibile per una migliore quantificazione dei campioni ambientali al fine di permettere una più efficace prevenzione.