Il ruolo della proteolisi muscolare nella cachessia neoplastica, focus sull'autofagia.

Many tumors, as well as several chronic diseases, are characterized by the appearance of cachexia. Cachexia is a multifactorial syndrome characterized by the alteration of carbohydrate, protein and lipid metabolism, often associated with anorexia. The syndrome is complicated by the onset of a systemic inflammatory state, by alterations of the humoral homeostasis and anemia.The most common feature of cancer cachexia is the progressive loss of body weight, mainly deriving from depletion of both skeletal muscle and adipose tissue. The depletion of skeletal muscle causes asthenia and reduced mobility, both features of cachexia. Cancer-induced muscle wasting is mainly due to accelerated protein breakdown which is operated by four intracellular proteolytic systems. The ATP-ubiquitin-dependent proteolytic system is very important for the degradation of myofibrillar proteins. The lysosomal-autophagic system has also been proposed to contribute to muscle wasting. Aim of this work was to test if the modulation of muscle autophagy could be able to counteract muscle atrophy in experimental models of cancer cachexia. In order to block stress-induced autophagy, animals have been subjected to electroporation of two different plasmids in the tibialis anterior muscle, the first encoding a short hairpin RNA has been used to silence Beclin-1 (sh-Becn1) and alternatively a plasmid encoding a triple mutant form of Bcl-2 protein (Bcl-2-AAA) has been used. Bcl-2-AAA doesn't allow the formation of autophagosomes, because it retains Beclin-1 protein in an inactive form. The results show that autophagic degradation is reduced in sh-Becn1 electroporated tibialis of C26 colon carcinoma-bearing mice. They show an accumulation of p62, suggesting a greater accumulation of substrates that are not degraded. In the sh-Becn1 electroporated tibialis of C26-bearing mice, the suppression of autophagy results in muscle weight recovery, compared to the tibialis transfected with the control plasmid (SCR), suggesting a role of the lysosomal-autophagic system in muscle wasting. However, myofibers of the sh-Becn1 electroporated tibialis of C26-bearing mice don't show a significant rescue of Cross-Sectional Area (CSA) and improved morphology, compared to the SCR electroporated tibial, suggesting that autophagy blockade impairs muscle homeostasis. Conversely, the excessive stimulation of muscle autophagy, experimentally obtained by the overexpression of TP53INP2 (also known as DOR), induces muscle atrophy in Lewis Lung carcinoma (LLC)-bearing mice. At last, C26-bearing mice were treated with Formoterol, a selective β2-agonist used in the treatment of bronchospasm, which increases skeletal muscle mass. In particular, in C26-bearing mice, the treatment with Formoterol protects heart and skeletal muscle against muscle atrophy, by antagonizing the protein degradation that characterizes cancer cachexia. After formoterol administration, the levels of autophagy-related proteins, p62, LC3B II and Beclin-1 are reduced, suggesting a regulation of the lysosomal-autophagic system in response to the administration of this drug. In conclusion, the results suggest that autophagic degradation plays an important role in the induction of muscle atrophy, and that muscle atrophy prevention shouldn't be pursued through direct inhibition of autophagy but through strategies that block molecular signals upstream the lysosomal-autophagic system activation.

La maggior parte delle neoplasie, così come diverse patologie croniche, sono caratterizzate dalla comparsa della cachessia. La cachessia è una sindrome multifattoriale caratterizzata dall'alterazione del metabolismo dei carboidrati, delle proteine e dei lipidi, spesso accompagnata da anoressia. Il tutto è complicato dall'insorgenza di uno stato infiammatorio sistemico, da alterazioni dell'omeostasi umorale ed anemia. La manifestazione più diffusa della cachessia neoplastica è la progressiva perdita di peso corporeo dovuta principalmente ad ipotrofia tessutale, conseguente alla deplezione proteica della muscolatura scheletrica ed all'impoverimento delle riserve di tessuto adiposo. Il deperimento del muscolo scheletrico determina astenia e ridotta mobilità, entrambe caratteristiche della cachessia. La deplezione del muscolo scheletrico dipende principalmente dall'ipercatabolismo proteico che è operato, in modo diverso, da quattro sistemi proteolitici intracellulari. La rilevanza del sistema proteolitico ATP-ubiquitina-dipendente nella degradazione delle proteine miofibrillari è stata già riconosciuta; anche il sistema proteolitico lisosomico-autofagico è stato proposto contribuire al deperimento muscolare che caratterizza la cachessia. In questo lavoro si è voluto verificare se la modulazione muscolo specifica dell'autofagia sia in grado di contrastare l'atrofia muscolare in modelli sperimentali di cachessia neoplastica. Per bloccare l'autofagia indotta da stress, gli animali sono stati sottoposti al trasferimento genico, nel muscolo tibiale anteriore, di due distinti plasmidi: uno codificante uno short hairpin RNA per silenziare direttamente Beclin-1 (sh-Becn1) e, in alternativa, è stato utilizzato un plasmide che codifica per un triplo mutante della proteina mitocondriale Bcl-2 (Bcl-2-AAA) che trattiene inattiva la proteina Beclin-1, non permettendo la formazione di autofagosomi. I risultati mostrano come la degradazione autofagica sia ridotta nei tibiali elettroporati con sh-Becn1 dei topi portatori del carcinoma al colon 26 (C26) che, infatti, evidenziano un accumulo della proteina p62, suggerendo che vi sia un maggiore accumulo di substrati che non vengono degradati. Inoltre, la soppressione dell'autofagia nel tibiale elettroporato con sh-Becn1, degli animali portatori di C26, risulta in un recupero del peso del muscolo stesso rispetto al tibiale trasfettato con il plasmide di controllo (SCR), suggerendo quindi un ruolo del sistema lisosomico-autofagico nell'atrofia muscolare. Tuttavia, le miofibre del tibiale elettroporato con sh-Becn1, non evidenziano un significativo recupero della ¿Cross-Sectional Area¿ (CSA) e un miglioramento nella morfologia rispetto al tibiale elettroporato con il plasmide SCR, suggerendo quindi che il blocco dell'autofagia compromette il corretto trofismo muscolare. All'opposto, l'eccessiva stimolazione della degradazione autofagica muscolare, ottenuta sperimentalmente iperesprimendo la proteina TP53INP2 (nota anche come DOR), aumenta il grado di atrofia nei topi portatori del carcinoma polmonare di Lewis (LLC). Infine, è stato visto che il trattamento con Formoterolo, un agonista β2 selettivo indicato nel trattamento del broncospasmo, incrementa la massa muscolare scheletrica. In particolare, nei topi portatori di adenocarcinoma del colon C26 protegge il cuore ed il muscolo scheletrico nei confronti dell'atrofia muscolare.