Il frazionamento isotropico: un metodo innovativo per l'analisi quantitativa di patologie del sistema nervoso centrale

Un obiettivo importante nelle neuroscienze traslazionali e quantitative è quello di poter disporre di un metodo preciso e veloce per contare i neuroni, che permetta di lavorare su grande scala e di ottenere risultati affidabili. In questo lavoro è stato testato il metodo del frazionamento isotropico per valutare la perdita di cellule neuronali e non neuronali in alcuni modelli sperimentali di malattie del sistema nervoso centrale, utilizzando ratti Sprague-Dawley di 2-4 mesi. In un primo gruppo sperimentale (n=3) è stato indotto un danno ischemico tramite occlusione permanente dell'arteria cerebrale media (MCAo); tramite iniezione intraperitoneale con acido kainico (KA) sono state provocate crisi epilettiche in un secondo gruppo di animali (n=3); infine per mimare l'Huntington umano è stato iniettato acido chinolinico (QA) nello striato di un terzo gruppo sperimentale (n=3). I campioni di ippocampo dei ratti trattati con acido kainico e quelli di striato dei ratti trattati con acido chinolinico sono stati accuratamente dissezionati tramite un microscopio da dissezione e una matrice per cervello di ratto. Le sezioni dei cervelli sottoposti ad ischemia sono state prima processate per la colorazione con Triphenyl-Tetrazolium Chloride (TTC) e poi per il frazionamento isotropico. Nel gruppo ischemico la perdita di cellule osservata corrisponde alla perdita neuronale, suggerendo che l'ipossia coinvolge prevalentemente i neuroni. Combinando il frazionamento isotropico con la colorazione TTC si è correlato il volume della lesione con la perdita neuronale. Attraverso il frazionamento isotropico è stato inoltre dimostrato che la perdita neuronale avviene anche nel lato controlaterale al lato ischemico. Nel gruppo epilettico è stata osservata una riduzione del numero di cellule neuronali nei ratti trattati, e sono stati valutati i cambiamenti nel numero delle cellule non neuronali in risposta al danno ippocampale. Nel gruppo trattato con acido chinolinico si è vista una notevole riduzione delle cellule neuronali nello striato omolaterale. Questa perdita non è legata ad un cambiamento significativo nel numero totale di cellule, suggerendo quindi che il danno eccitotossico nello striato attiva fortemente l'infiammazione e la proliferazione gliale. Il metodo del frazionamento isotropico quindi rappresenta una tecnica semplice e affidabile per contare le cellule, al fine di valutare gli effetti di lesioni sperimentali che mimano patologie umane. Può anche essere utilizzato per studiare gli effetti neuroprotettivi e/o antinfiammatori di possibili trattamenti sul cervello nella sua interezza o in particolari regioni di interesse, con la possibilità di investigare anche alterazioni non neuronali. Inoltre questo metodo può essere impiegato in aggiunta o in sostituzione alle classiche tecniche stereologiche usate finora, poichè è veloce, preciso ed è possibile affiancarlo a complesse analisi molecolari.