La liprina-α1 regola la funzione ed il traffico dell'integrina β1 in modo Rab21 dipendente

At the Institute for Cancer Research and Treatment (IRCC), the group of Professor Serini is conducting a series of studies on the regulation of the functions of integrins in tumor angiogenesis. In this context, my thesis is devoted to verify the role played by liprin-α1 and Rab21 GTPase. Attention has focused on these two proteins because liprin-α1 is expressed in all the tissues, is involved in the trafficking and regulates disassembly of focal adhesions; while the small GTPase Rab21 is involved in the trafficking of integrins. First I checked if liprin-α1 binds to total integrin α5β1 or only the fraction displaying the active conformation, by means of co-immunoprecipitation experiments from EC lysates. The analysis showed that liprin-α1 interacts selectively with β1 integrins in the active conformation. In order to understand with which chain of α5β1 integrin liprin-α1 interacted, I performed a pull down experiment, using the cytoplasmic tails of both integrin subunits, one fused with Jun protein and the other with the Fos protein. Co incubated Jun and Fos dimerize to mimic the interaction that occurs between the cytoplasmic domains of inactive α5β1 integrin subunits. If kept separate, they mimic the conformation of active integrins. It turned out that liprin-α1 binds to the cytoplasmic tail of the β1 subunit, but not to the α5 subunit, the interaction between the cytoplasmic domains of α5 and β1 inhibits the association between liprin-α1 and β1 integrin subunit, confirming that the interaction occurs only when the α5β1 dimer is in active conformation. I then demonstrated, by co-immunoprecipitation experiments from EC lysates, that co-localization of Rab21 and liprin-α1, previously evidenced by immunofluorescence experiments, is due to a real interaction between the two proteins. To test whether this interaction depended on the state of activation of Rab21, I performed pull-down experiments on EC lysate, using GST-Rab21*GTPγS, GST-Rab21*GDP, GST-Rab5*GTPγS or GST-Rab5*GDP as bait, and concluded that liprin-α1 interacts with Rab21 only when this is bound to GTP and is, therefore, active. To test whether the interaction between the Rab21 and α5β1 integrin is influenced by the presence of liprin-α1, I did co-immunoprecipitation experiments from EC lysates where I had previously silenced the gene of liprin-α1 and EC lysates of control. I have shown that the integrin α5β1 immunoprecipitates with Rab21 both in presence and absence of liprin-α1, but the rate of integrin α5β1 that immunoprecipitates with Rab21 is clearly greater in the absence of liprin-α1. I then verified, by immunofluorescence analysis, if this is correlated with a different localization of integrin α5β1 in different endosomal compartments. This analysis showed that in cells where there isn't liprin-α1 there is an increased co-localization between integrin α5β1 and Lamp1, a marker of late endosomes. Overall, the results suggest that the kinetics of endocytosis and the subsequent recycling of integrin α5β1 in active conformation depend on the interaction between Rab21 and liprin-α1. It can be assumed that in the presence of liprin-α1, the transient binding of Rab21 to the active internalized integrin ensures a rapid recycling. While, in the absence of liprin-α1, the prolonged binding of Rab21 to internalised active integrin leads the integrin to late endosomal compartments, extending the recycling time and impairing cell adhesion to the extracellular matrix.

Presso l'IRCC di Candiolo il gruppo del professor Serini sta conducendo una serie di ricerche sulla regolazione delle funzioni delle integrine nell'angiogenesi tumorale. In questo ambito la mia tesi è dedicata a verificare il ruolo svolto dalla liprina-α1 e dalla GTPasi Rab21. L'attenzione si è focalizzata su queste proteine perché la liprina-α1 è espressa in modo ubiquitario nei tessuti, è coinvolta in fenomeni di traffico e regola il disassemblaggio delle adesioni focali, mentre la GTPasi Rab21 è coinvolta nel traffico delle integrine. Per prima cosa ho verificato, tramite un esperimento di co-immunoprecipitazione da lisati di CE, se la liprina-α1 si legasse all'integrina α5β1 totale o solo a quella attiva. L'analisi ha mostrato come liprina-α1 interagisca selettivamente con l'integrina β1 attiva. Per comprendere con quale delle catene dell'integrina α5β1 interagisse la liprina-α1, ho poi eseguito un esperimento di pull down, utilizzando le code citoplasmatiche delle due subunità integriniche fuse l'una con la proteina Jun e l'altra con la proteina Fos. Se co-incubate Jun e Fos dimerizzano, mimando l'interazione che avviene tra le subunità dell'integrina α5β1 inattiva, se mantenute separate mimano invece la conformazione dell'integrina attiva. È risultato che liprina-α1 si lega alla coda citoplasmatica della subunità β1, ma non della subunità α5; inoltre l'interazione tra i domini citoplamatici di α5 e β1 inibisce l'associazione tra liprina-α1 e la subunità β1, confermando che l'interazione avviene soltanto quando il dimero α5β1 è in conformazione attiva. Ho poi dimostrato, tramite esperimenti di co-immunoprecipitazione da lisati di CE, che la co-localizzazione di Rab21 e liprina, evidenziata tramite immunofluorescenza, è dovuta ad una reale interazione fra le due proteine. Per verificare se tale interazione dipendesse dallo stato di attivazione della Rab21 ho eseguito esperimenti di pull down su lisati di CE, impiegando come esca GST-Rab21*GTPγS, GST-Rab21*GDP, GST-Rab5*GTPγS o GST-Rab5*GDP, concludendo che liprina-α1 interagisce con Rab21 soltanto quando quest'ultima è legata a GTP e quindi è attiva. Per verificare se l'interazione fra la proteina Rab21 e l'integrina α5β1 fosse influenzata dalla presenza di liprina-α1, ho svolto un esperimento di co-immunoprecipitazione sia da lisati di CE in cui avevo precedentemente silenziato il gene della liprina-α1, sia da lisati di CE di controllo. Ho evidenziato come l'integrina α5β1 immunoprecipiti con Rab21 sia in presenza che in assenza di liprina-α1, ma la quota di integrina α5β1 che immunoprecipita con Rab21 è nettamente maggiore in assenza di liprina-α1. Ho quindi verificato, tramite analisi di immunofluorescenza, se ciò correlasse con una differente localizzazione dell'integrina α5β1 in diversi compartimenti endosomali. Tale analisi ha mostrato che in cellule in cui non è presente la liprina-α1 vi è una maggiore co-localizzazione fra l'integrina α5β1 e Lamp1, marcatore degli endosomi tardivi. I risultati suggeriscono che dall'interazione fra Rab21 e liprina-α1 dipendano la cinetica di endocitosi e di riciclo dell'integrina α5β1 in conformazione attiva. Si può ipotizzare che in presenza di liprina-α1, il legame transitorio di Rab21 all'integrina attiva internalizzata garantisca un rapido riciclo, mentre, in assenza di liprina-α1, il legame prolungato dell'integrina attiva internalizzata a Rab21 la instraderebbe verso il compartimento endosomale tardivo, prolungandone il tempo di riciclo