Background: As stated by the latest guidelines, Percutaneous Coronary Intervention (PCI) is the treatment of choice in patients with Acute Coronary Syndrome (ACS). Despite the benefits offered by this technique, the Ischemia/Reperfusion (I/R) damage still represents one of most relevant limitations and has been therefore the objective of several studies. Over the last years some preconditioning procedures have shown their value in this field. This is particularly true for the Remote Ischemic PreConditioning (RIPC) which has been the objective of several clinical trials without great success in term of patient’s outcome. Among the biological mechanisms involved in the protection against the I/R damage, the role of extracellular vesicles (EV) has gained particular relevance. However, their role in mediating cardioprotection when recovered from ACS patients was never investigated. In this study, we aimed to investigate the role of serum EV recovered from ACS patients (unstable angina [UA] and NSTEMI) and undergoing RIPC, as possible mediators of cardioprotection in the setting of I/R injury. Methods and results: A double-blind, randomized controlled trial was conduced. 30 patients were recruited and randomly assigned to undergo the RIPC or sham procedure. EV-RIPC and EV-naive were isolated from arterial blood samples recovered before PCI by a precipitation method. EV were analyzed by electron microscopy (TEM), flow cytometry (FACS) and western-blot. We found that troponin T (TnT) was enriched in patients’ EV compared to healthy controls and regardless of diagnosis at admission. EV-naive, unlike EV-RIPC, protect against I/R damage both in the in-vitro (transwell method) and in the ex-vivo model (isolated rat heart). To investigate their mechanism of action, the most relevant intracellular pathways involved in cardioprotection were therefore investigated: the Survivor Activating Factor Enhancement (SAFE) through its effector STAT-3 and the Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK) via Erk-1/2. We noticed that EV-naive mediate STAT-3 phosphorylation, while EV-RIPC activate Erk-1/2 in the isolated rat heart. Using the specific inhibitor of STAT-3 (STATTIC) and Erk-1/2 (U0126), we confirmed the relevance of STAT-3 in EV-naive mediated protection. Furthermore, we demonstrated that the inhibition of Erk-1/2 restores the activation of STAT-3 and cardioprotection upon EV-RIPC treatment. We have also analyzed the EV-cargo focusing on their mRNA content. One of the mRNAs particularly expressed in EV-naive encodes for the Dual Gene Phosphatase 6 (DUSP6), a phosphatase involved in the inhibition of Erk1/2. We found that DUSP6 silencing by specific siRNA inhibits STAT-3 phosphorylation and the cardioprotective effect induced by EV-naive. Conclusions: This study granted the identification of an effective and simple method for serum EV isolation, thus highlighting its possible application in the clinical practice as an autologous source. In fact, this study demonstrated that EV-naive exert a cardioprotective effect both in-vitro and ex-vivo, and their mechanism of action was, at least in part, identified. However, given the sample size, this should be considered as a pilot study that will require further investigation to better understand the real effectiveness of EV in ACS patient.
Background: Come evidenziato nelle più recenti linee guida l’angioplastica percutanea (PCI) rappresenta il trattamento di scelta nel paziente con sindrome coronarica acuta (ACS). Nonostante i benefici di questa tecnica di rivascolarizzazione, il danno da ischemia/riperfusione (I/R) rappresenta ancora uno dei suoi limiti e pertanto è a tutt’oggi oggetto di numerosi studi. Alcune procedure di precondizionamento hanno mostrato negli anni una particolare valenza, in particolare il precondizionamento ischemico remoto (RIPC) è stato oggetto di numerosi trial che non hanno però dimostrato un reale beneficio. Tra i meccanismi biologici implicati nella protezione dal danno da I/R le vescicole extracellulari (EV) hanno attratto particolare interesse anche se il loro ruolo è stato poco studiato in pazienti con ACS. Il questo studio abbiamo quindi indagato se e come le EV sieriche isolate da pazienti con diagnosi di ACS (angina instabile [UA] e NSTEMI) e sottoposti a RIPC potessero mediare la cardioprotezione in corso di I/R e quindi poter essere considerate utili nella pratica clinica. Metodi e risultati: È stato condotto un trial randomizzato controllato a doppio cieco dove sono stati reclutati 30 pazienti assegnati ad un gruppo sottoposto alla procedura di RIPC e ad un altro di controllo (sham). Da questi sono state isolate rispettivamente EV-RIPC e EV-naive mediante prelievo di sangue arterioso eseguito prima della PCI. In particolare, per l’isolamento è stata utilizzata la metodica di precipitazione. Le EV sono state analizzate tramite microscopia elettronica (TEM), citometria a flusso (FACS) e western-blot. Le EV dei pazienti sono risultate ricche in troponina (TnT) rispetto ai controlli sani e indipendentemente dalla diagnosi all’ingresso. Le EV-naive, a differenza delle EV-RIPC, risultano in grado di proteggere dal danno da I/R. Ciò si verifica sia in un modello in-vitro (metodica transwell) sia in un modello ex-vivo (cuore isolato di ratto). Al fine di indagare i meccanismi alla base della cardioprotezione sono state studiate le due vie intracellulari implicate maggiormente in questo processo: la via definita Survivor Activating Factor Enhancement (SAFE) tramite il suo effettore STAT-3 e la via indicata come Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK) che riconosce Erk-1/2 come mediatore. Abbiamo osservato che le EV-naive inducono la fosforilazione di STAT-3, mentre le EV-RIPC attivano Erk-1/2 nel cuore di ratto. Utilizzando i specifici inibitori di STAT-3 (STATTIC) e di Erk-1/2 (U0126) è stato confermato il ruolo di STAT-3 nel mediare la protezione fornita dalle EV-naive. Inoltre, abbiamo osservato che l’inibizione di Erk-1/2 è in grado di ripristinare l’attivazione di STAT-3 a seguito di trattamento con EV-RIPC. Ciò si traduce in un effetto cardioprotettivo. Abbiamo analizzato inoltre il contenuto delle EV focalizzandoci in particolare sugli mRNA. Uno degli mRNA particolarmente espresso nelle EV-naive è risultato essere quello codificante la Dual Gene Phosphatase 6 (DUSP6), fosfatasi coinvolta nell’inibizione di Erk1/2. Silenziando DUSP6 mediante lo specifico siRNA abbiamo dimostrato che la fosforilazione di STAT-3 e la cardioprotezione indotte dalle EV-naive risultano inibite. Conclusioni: Questo studio ha permesso l’identificazione di un metodo di isolamento di EV sieriche efficace e semplice, evidenziando quindi un suo possibile utilizzo nella pratica clinica come fonte autologa. Le EV-naive hanno infatti mostrato un effetto cardioprotettivo in-vitro ed ex-vivo e ne sono stati studiati i meccanismi molecolari coinvolti. Data però la modesta numerosità campionaria, questo deve essere considerato uno studio pilota che necessiterà di ulteriori indagini per comprendere meglio l’efficacia reale delle EV nel paziente con ACS.
Ruolo delle vescicole extracellulari (EV) da pazienti con sindrome coronarica acuta (ACS) nel danno da ischemia-riperfusione
RAVERA, FRANCESCO
2020/2021
Abstract
Background: Come evidenziato nelle più recenti linee guida l’angioplastica percutanea (PCI) rappresenta il trattamento di scelta nel paziente con sindrome coronarica acuta (ACS). Nonostante i benefici di questa tecnica di rivascolarizzazione, il danno da ischemia/riperfusione (I/R) rappresenta ancora uno dei suoi limiti e pertanto è a tutt’oggi oggetto di numerosi studi. Alcune procedure di precondizionamento hanno mostrato negli anni una particolare valenza, in particolare il precondizionamento ischemico remoto (RIPC) è stato oggetto di numerosi trial che non hanno però dimostrato un reale beneficio. Tra i meccanismi biologici implicati nella protezione dal danno da I/R le vescicole extracellulari (EV) hanno attratto particolare interesse anche se il loro ruolo è stato poco studiato in pazienti con ACS. Il questo studio abbiamo quindi indagato se e come le EV sieriche isolate da pazienti con diagnosi di ACS (angina instabile [UA] e NSTEMI) e sottoposti a RIPC potessero mediare la cardioprotezione in corso di I/R e quindi poter essere considerate utili nella pratica clinica. Metodi e risultati: È stato condotto un trial randomizzato controllato a doppio cieco dove sono stati reclutati 30 pazienti assegnati ad un gruppo sottoposto alla procedura di RIPC e ad un altro di controllo (sham). Da questi sono state isolate rispettivamente EV-RIPC e EV-naive mediante prelievo di sangue arterioso eseguito prima della PCI. In particolare, per l’isolamento è stata utilizzata la metodica di precipitazione. Le EV sono state analizzate tramite microscopia elettronica (TEM), citometria a flusso (FACS) e western-blot. Le EV dei pazienti sono risultate ricche in troponina (TnT) rispetto ai controlli sani e indipendentemente dalla diagnosi all’ingresso. Le EV-naive, a differenza delle EV-RIPC, risultano in grado di proteggere dal danno da I/R. Ciò si verifica sia in un modello in-vitro (metodica transwell) sia in un modello ex-vivo (cuore isolato di ratto). Al fine di indagare i meccanismi alla base della cardioprotezione sono state studiate le due vie intracellulari implicate maggiormente in questo processo: la via definita Survivor Activating Factor Enhancement (SAFE) tramite il suo effettore STAT-3 e la via indicata come Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK) che riconosce Erk-1/2 come mediatore. Abbiamo osservato che le EV-naive inducono la fosforilazione di STAT-3, mentre le EV-RIPC attivano Erk-1/2 nel cuore di ratto. Utilizzando i specifici inibitori di STAT-3 (STATTIC) e di Erk-1/2 (U0126) è stato confermato il ruolo di STAT-3 nel mediare la protezione fornita dalle EV-naive. Inoltre, abbiamo osservato che l’inibizione di Erk-1/2 è in grado di ripristinare l’attivazione di STAT-3 a seguito di trattamento con EV-RIPC. Ciò si traduce in un effetto cardioprotettivo. Abbiamo analizzato inoltre il contenuto delle EV focalizzandoci in particolare sugli mRNA. Uno degli mRNA particolarmente espresso nelle EV-naive è risultato essere quello codificante la Dual Gene Phosphatase 6 (DUSP6), fosfatasi coinvolta nell’inibizione di Erk1/2. Silenziando DUSP6 mediante lo specifico siRNA abbiamo dimostrato che la fosforilazione di STAT-3 e la cardioprotezione indotte dalle EV-naive risultano inibite. Conclusioni: Questo studio ha permesso l’identificazione di un metodo di isolamento di EV sieriche efficace e semplice, evidenziando quindi un suo possibile utilizzo nella pratica clinica come fonte autologa. Le EV-naive hanno infatti mostrato un effetto cardioprotettivo in-vitro ed ex-vivo e ne sono stati studiati i meccanismi molecolari coinvolti. Data però la modesta numerosità campionaria, questo deve essere considerato uno studio pilota che necessiterà di ulteriori indagini per comprendere meglio l’efficacia reale delle EV nel paziente con ACS.| File | Dimensione | Formato | |
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