"Studio sui determinanti cellulari della sindrome di Rett: ruolo degli interneuroni parvalbumina corticali nei deficit motori mostrati da topi mecp2 mutanti"

Rett syndrome (RTT) is a neurodevelopmental disorder occurring 1/10,000 girls worldwide that is caused, in the majority of cases, by the mutations in the X- linked gene MECP2 (methyl CpG-binding protein 2). Clinical features of the disorder appear shortly after a period of normal development and consist in marked developmental regression of acquired skills together with the emergence of severe motor and cognitive dysfunctions. Strong evidences support the idea that RTT symptoms derive from the alteration of excitory/inhibitory (E/I) balance of neocortical circuits. In this scenario, we recently found that Mecp2 loss affects the assembly of parvalbumin-expressing GABAergic interneurons (PV INs), a defect that is associated with increased excitatory drive onto these cells leading to somatosensory cortex (S1) hypoactivity. However, whether PV alterations precedes the onset of RTT symptoms and what is the impact of the lack of Mecp2 on PV cells activity in response to a behavioral task is still unknown. Thus, the purpose of my thesis project was to investigate PV INs network in S1 cortex of presymptomatic (4-weeks-old) and severely symptomatic (8-weeks- old) Mecp2 knockout mice (Mecp2-/y). Given that recent studies demonstrated that PV immunoreactivity in PV INs correlate with their activity, I used an immunohistochemical approach to analyze PV levels of expression. This analysis revealed an increased density of PV INs that express high level of PV in Mecp2-/y mice compared to WT before the onset of symptoms. Thereafter, since one of the characteristic of this pathology are motor deficits, I focus my investigation in the M1 cortex of Mecp2-/y mice where I found that PV levels are also increased, similarly to the S1 cortex. Moreover, I tested PV cells responsivity following M1 stimulation using a motor task (accelerated rotarod for 2 days) in both WT and of Mecp2-/y mice. This study shows that PV-expressing cells in Mecp2-/y mice react to motor performance increasing PV expression level while PV cells in WT animals show an opposite phenotype. Finally, when I evaluated the number of excitatory and inhibitory synapses that contact PV INs with confocal microscopy, I found an increased density of excitatory synapses in Mecp2-/y mice both before and after motor training. In conclusion, my research suggests that, due to exaggerated excitatory connectivity, PV network activity is enhanced in Mecp2-/y mice, probably leading to a marked increase of inhibitory drive in the cortex. Such deficiency, in turn, severely affects experience-dependent plasticity in mutant mice.

La sindrome di Rett (RTT) è una neuropatologia dello sviluppo che colpisce 1/10,000 bambine nel mondo, ed è causata nella maggior parte dei casi da una mutazione X-linked del gene MECP2 (methyl CpG-binding protein 2). Le caratteristiche cliniche di questa malattia si manifestano dopo un breve periodo di vita normale e comprendono una marcata regressione delle capacità intellettive e gravi deficit motori. Recenti studi hanno evidenziato come la sintomatologia associata alla RTT derivi da una alterazione dell'equilibrio tra eccitazione ed inibizione (E/I) che guida la corretta funzionalità dei circuiti neocorticali. In questo contesto, abbiamo recentemente dimostrato che la mancanza di Mecp2 altera la maturazione degli interneuroni GABAegici che esprimono parvalbumina (IN PV) e causa un incremento del tono eccitatorio su queste cellule che si riflette in una ipoattività della corteccia somatosensoriale primaria (S1). Rimane tuttavia ignoto come l'alterazione degli IN PV possa essere coinvolta nel manifestarsi della sintomatologia della RTT e quale sia l'impatto dell'assenza di Mecp2 sull'attività delle cellule che esprimono PV in risposta a stimoli comportamentali. Lo scopo del mio progetto di tesi è stato quello di studiare il network degli IN PV nella corteccia S1 di topi Mecp2 knockout (Mecp2-/y) sia in uno stadio pre- sintomatico (quattro settimane di età) sia in uno gravemente sintomatico (otto settimane di età). Poichè studi recenti hanno messo in evidenza una correlazione tra i livelli di espressione di PV degli IN PV e la loro stato di attivazione, ho analizzato tali livelli nei topi mutanti per Mecp2 utilizzando un approccio di tipo immunoistochimico su sezioni di corteccia. Questa analisi ha evidenziato un incremento della densità degli IN PV che esprimono alti livelli di PV nei topi Mecp2-/y rispetto ai controlli wild-type (WT) prima dell'insorgenza dei sintomi. Successivamente, siccome i deficit motori sono una caratteristica costante della patologia, mi sono focalizzata sullo studio degli IN PV della corteccia motoria primaria (M1) negli animali mutanti dove ho rilevato un aumento della PV simile a quello osservato in S1. Inoltre, ho testato la responsività degli IN PV della M1 in seguito ad una stimolazione motoria (rotarod accelerato della durata di due giorni) sia nei topi Mecp2-/y sia nei topi WT. Questa analisi ha messo in luce che gli IN PV nei topi mutanti reagiscono al test motorio innalzando i livelli di espressione di PV a differenza dei controlli WT che mostrano un comportamento opposto. In fine, ho analizzato attraverso la microscopia confocale il numero ed il tipo di sinapsi che contattano gli IN PV sia a livello del soma sia a livello dei dendriti. Grazie a questa analisi ho scoperto che, mentre il genotipo non influisce sul numero delle sinapsi inibitorie, il numero di quelle eccitatorie sui dendriti degli IN PV mutanti è maggiore rispetto agli animali WT, sia prima che dopo il training motorio. In conclusione, la mia ricerca suggerisce che il network degli interneuroni PV è più attivo nei topi Mecp2- /y a causa di una eccessiva connettività eccitatoria. A questa anomalia, fa seguito un marcato incremento del tono inibitorio nella corteccia cerebrale che si ripercuote sulle risposte plastiche dipendenti dall'esperienza nei topi mutanti.