Azione dei fitoestrogeni sui circuiti cerebrali che controllano comportamenti sessualmente dimorfici

L'obiettivo di questa tesi è quello di determinare se l'esposizione precoce alla genisteina, fitoestrogeno della soia, possa alterare il comportamento ansioso e/o i circuiti neurali ad esso correlati, in topi di sesso maschile e femminile, mimando l'azione dell'estradiolo; considerando il comportamento di tipo ansioso, basandomi su studi presenti in letteratura, ho analizzato il sistema responsabile della produzione dell'ossido nitrico (NO) nel nucleo paraventricolare dell'ipotalamo, poichè esso fa parte dell'asse ipotalamico-ipofisario-adrenergico o 'asse dello stress'. Nella prima parte del mio esperimento, ho considerato 30 animali maschi e 30 animali femmine, suddividendo ciascun gruppo in 10 animali sottoposti a somministrazione orale di olio di sesamo (controllo), 10 animali trattati con estradiolo (controllo positivo) e 10 animali trattati con genisteina, dal primo all'ottavo giorno postnatale. All'età di due mesi, essi sono stati sottoposti a due test comportamentali, l'open field test e l'elevated plus maze test, al fine di valutare il loro livello di ansia. Queste analisi hanno dimostrato che la genisteina altera il comportamento ansioso: in particolare, nei topi di sesso femminile, la genisteina induce un effetto di tipo ansiolitico se comparato al gruppo di controllo e al gruppo trattato con estradiolo, mentre nei maschi, la somministrazione di genisteina produce un effetto di tipo ansiogenico solo rispetto al gruppo di controllo. E' interessante notare infatti che, nei maschi, l'estradiolo determina un effetto più ansiogenico di quello dovuto alla genisteina. In base ai dati ottenuti dall'analisi del comportamento, ho svolto un'analisi quantitativa sul sistema che produce l'ossido nitrico nel nucleo paraventricolare dell'ipotalamo. Più in dettaglio, ho contato i neuroni che esprimono l'ossido nitrico sintasi, resi visibili in seguito a reazione immunoistochimica, su quattro suddivisioni del paraventricolare di 15 topi maschi, di cui 5 trattati con olio, 5 con estradiolo e 5 con genisteina. L'analisi statistica, nonostante i diversi trattamenti, non ha rivelato differenze significative nel numero di cellule che esprimono quest'enzima. Dai risultati suddetti si possono trarre diverse conclusioni: nelle femmine, la somministrazione di genisteina esercita un'azione ansiolitica dovuta alla modulazione locale dell'enzima aromatasi. Potremmo ipotizzare che la genisteina, nel sistema nervoso centrale, vada a stimolare l'espressione dell'aromatasi, che a sua volta incrementerebbe la produzione di estrogeni, quindi l'effetto ansiolitico. Nei maschi la genisteina non agisce come inibitore dell'aromatasi ma opera come distruttore endocrino, mimando l'azione dell'estradiolo in seguito a legame con i recettori ERβ determinando un effetto finale di tipo ansiogeno. Dal momento che i dati ottenuti dalla conta cellulare non sono statisticamente rilevanti, possiamo concludere che il sistema nitrergico non è influenzato dalla somministrazione di genisteina. In futuro sarebbe opportuno analizzare l'amigdala e/o l'ippocampo coinvolti nel controllo emozionale e per avere una visione generale sul ruolo della genisteina, si dovrebbe effettuare una conta cellulare anche sulle femmine. In conclusione, riferendoci allo scopo di questo lavoro e sulla base dei risultati ottenuti, è lecito chiedersi quali effetti possa provocare l'esposizione precoce della genisteina nella nostra specie, poichè molti neonati vengono alimentati con latte di soia.

The aim of this work is to determine if early exposure to the soy phytoestrogen genistein, mimicking the action of the estradiol, may alter anxious behaviour and/or related circuits in male and female mice. Among different neural circuits involved in this complex behaviour I chose to examine the NO-producing system within the paraventricular nucleus (PVN) of hypothalamus, since it is involved in the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA-axis) or stress axis. In the first part of my experiment, I considered 30 male and 30 female mice, divided in groups of 10 animals subjected to orally administration of oil (control), estradiol (positive control) or genistein, from postnatal day PD1 to PD8. When animals were 2 months old, they were subjected to two behavioural test: the open field test and the elevated plus maze test, in order to evaluate the anxiety levels in males and females. My results indicate that genistein-treated mice show alterations of anxiety levels: in particular, genistein in females had an anxiolytic effect, comparing to control group and estradiol group, while in males genistein had an anxiogenic effect comparing to the oil-treated group.It is interesting to note that estradiol in mice induces a more anxiogenic effect than genistein. After the behavioural analysis, I investigated whether genistein administration produced alterations in neural circuits that regulate sexually dimorphic behaviours, as well as anxiety. In particular, I focused my attention on the NO¿producing system in the PVN. I performed a cellular count of neuronal nitric oxide synthase immunoreactive cells on four subdivisions of this nucleus of 15 male mice, 5 of which treated with oil, 5 treated with estradiol and 5 genistein-treated.The statistical analysis, in spite of different kinds of treatments, did not show any significant difference in the number of nNOS positive cells. These results allow us to hypothesise a series of conclusion: in females, genistein administration produces an anxiolytic effect probably due to the modulation of the activity of aromatase enzyme. It could be possible that genistein interacts directly with the aromatase gene, locally modulating its activity by stimulating aromatase expression; this could induce an increase of estrogen levels in the brain, determining the anxiolytic effect. In males, genistein is not an aromatase inhibitor but it acts as endocrine disrupting chemical, mimicking the estradiol effect by binding the ERβ and producing an anxiogenic effect. Present data obtained from cellular count of the PVN of male mice, do not show significant differences in the number of nNOS-producing neurons. Therefore, we must conclude that the NO-system of the PVN is not influenced by the early administration of genistein. As a future prospective, it would be interesting extend the analysis to the amygdala and/or to the hippocampus, two important nuclei of the limbic system known to be the site of emotional control. In addition, to have a complete picture about the role of genistein, it would be desirable verify whether the early administration of genistein in female mice affects or not the nitrergic system in PVN, or if the latter remains unchanged as in males. In conclusion, referring to the aim of this work, basing on these results, it is reasonable to ask questions about the possible effects that the early administration of genistein can cause also to our species, since nowadays so many babies are fed with soy milk.