STUDIO DEI POLIMORFISMI DEL GENE C4 IN PAZIENTI AFFETTI DA VASCULITE CRIOGLOBULINEMICA

Vasculitis are chronic inflammatory autoimmune diseases. The mechanisms involved in the development of these pathologies are complex and have not been entirely clarified. Recently has been shown the association among a particular genomic region called RCCX module (6p21.3), situated in HLAIII region, and Systemic Lupus Eritematosus (SLE). RCCX module spanned 30 kb and include RP, C4, coding for the C4 fraction of complement cascade, CYP21 and TNX genes. Generally RCCX module is duplicated in tandem (bimodular structure) but, due to the elevated sequence homology in the region, unequal crossing-over can happen causing e formation of monomodular, trimodular and tetramodular alleles that differ for the number of RCCX modules present in cis on the same allele. C4 gene is highly polimorphic and it is coding for two protein variant, A and B, that differs for 4 aminoacid and show different electrophoretic mobility. Several evidences suggest that a reduction of the number of copies of the C4 gene is a risk factor for SLE, while there are no data concerning vasculitis associated to mixed (CRIO) crioglobulinemia disease that is characterized by severe ipocomplementemia. For this study 24 patient affected by CRIO, 16 by SLE, and 71 healthy volunteers were selected. The evaluation of the number of copies of C4 gene has been performed by real-time PCR with TaqMan probe. The calibrators have been selected in the group of controls by Southern Blotting. The presence of inactivating mutations has been detected by fluorescent primer extension. The majority of the controls shows the presence of 4 copies of C4gene (61%) followed by 3 copies (25,4%), 5 or more copies 12,7% and 2 copies 1,4%. Patients affected by SLE shows a meaningful reduction of the number of total copies of C4 gene compared to the group of control (P=0,01). 44% of the patients affected by SLE, had 4 copies of the gene, 37,5%, 3 copies and the 19% two copies. The patients affected by CRIO showed an increase of the total number of copies of C4 gene (4 copies 45,8%, 3 copies 20,8%, 2 copies 8,3%, 5 or more copies 25%). C4A analysis has shown that 44% of SLE patients has only one copy of C4A gene (vs controls P=0,112) and it has not been observed complete absence of C4A gene. CRIO patients has shown a frequency of C4A gene similar to control group. The analysis of the distribution of the number of copies of C4B was not different among SLE, CRIO and control group. Inactivating mutation analysis detected in 2 CRIO patients, bearing respectively 4 and 5 copies of total C4, the missense mutation R458W. The data of this study represent the first evaluation of C4 gene in patients affected by vasculitis secondary to mixed crioglobulinemia. Results, even though preliminary, suggest a possible role of C4 Gene Copy Number and the inactivating SNPs in circulating immunocomplexes vasculitis and could contribute to a better knowledge of factors involved in the immunomediated diseases.

Le vasculiti sono malattie infiammatorie croniche autoimmuni i cui meccanismi patogenetici non sono stati ancora del tutto chiariti, anche se numerosi studi hanno dimostrato un coinvolgimento sia di fattori ambientali che di fattori genetici predisponenti come i polimorfismi di alcuni geni coinvolti nella risposta immunitaria. È stata dimostrata l'associazione tra una particolare regione genomica (RCCX) ed il Lupus Eritematoso Sistemico (LES). Il modulo RCCX comprende 4 geni: RP, C4, che codifica per la frazione C4 del complemento, CYP21 e TNX. Generalmente il modulo RCCX è duplicato in tandem (struttura bimodulare) ma può andare incontro a crossing-over diseguale dando origine ad alleli monomodulari, trimodulari e tetramodulari che differiscono per il numero di moduli RCCX presenti in cis sullo stesso allele. Il gene C4 codifica per due isotipi, A e B. Sono state riportate evidenze che suggeriscono che una riduzione del n° di copie del gene C4 costituisca un fattore di rischio per il LES, mentre non esistono dati in letteratura riguardanti le vasculiti associate a crioglobulinemia mista (CRIO), caratterizzate da una grave ipocomplementemia. Sono stati selezionati per questo studio 24 pazienti affetti da CRIO, 16 da LES, che sono stati utilizzati come gruppo di controllo positivo e 71 volontari sani. Per la valutazione del numero di copie del gene C4 è stata utilizzata una metodica basata sulla real-time PCR con sonde TaqMan. I campioni calibratori sono stati selezionati nel gruppo di controlli dopo analisi di Southern Blotting. La presenza di mutazioni puntiformi inattivanti è stata ricercata mediante primer extension fluorescente. La maggioranza dei controlli mostra la presenza di 4 copie del gene C4 (61%). La frequenza degli individui con 3 copie è 25,4%, con 2 copie 1,4%, con 5 o più copie è 12,7%. Nei pazienti affetti da LES, è stata osservata una riduzione significativa del n° di copie totali del gene C4 rispetto al gruppo di controllo (P=0,01). Il 44% dei pazienti affetti da LES aveva 4 copie del gene, il 37,5% 3 copie e il 19% 2 copie. I pazienti affetti da vasculite crioglobulinemica mostravano una distribuzione diversa rispetto ai controlli con un aumento non statisticamente significativo del n° di copie del gene C4 totale (4 copie 45,8%, 3 copie 20,8%, 2 copie 8,3%, 5 o più copie 25%; CHI-QUADRO = 5,29; df = 3). L'analisi del n° di copie di C4A ha dimostrato che il 44% dei pazienti affetti da LES ha una sola copia di C4A (deficit di C4A in eterozigosi) rispetto al 18,3% dei controlli (P=0,112). Non è stata osservata nei pazienti affetti da LES il deficit in omozigosi dei geni C4A. L'analisi del C4A nel gruppo CRIO ha dimostrato la presenza di un n° di copie di C4A paragonabile ai controlli. L'andamento della distribuzione ha dimostrato una differenza significativa tra i tre gruppi (CHI-QUADRO=7,27; df=2; P=0,026). L'analisi della distribuzione del n° di copie di C4B ha dimostrato che non vi è nessuna differenza significativa tra pazienti affetti da LES, CRIO, gruppo di controllo. I dati di questo studio rappresentano la prima valutazione dei polimorfismi del C4 nelle vasculiti associate a crioglobulinemia mista. I risultati ottenuti suggeriscono un possibile ruolo del Gene Copy Number e degli SNPs inattivanti del C4 nelle vasculiti da deposito di immunocomplessi circolanti e potrebbero contribuire ad una miglior conoscenza dei meccanismi patogenetici coinvolti nelle malattie immunomediate.