Ruolo della Oncostatina M come induttore di transizione epitelio-mesenchima e di aumentata invasività in cellule neoplastiche di origine epatica

Oncostatin M (OSM), a pleiotropic cytokine belonging to the interleukin-6 (IL-6) family, was originally recognized by its inhibitory activity on the proliferation of tumor cells. Accumulating evidence now indicates that OSM exhibits many unique biological activities in inflammation, hematopoiesis, embryonic development, liver development, liver regeneration and liver fibrogenesis. In addition, it has recently been proposed that OSM might be involved in renal proximal tubular epithelial-mesenchymal transition (EMT), a phenotypic change that has been proposed to be involved in the pathogenesis of renal interstitial fibrosis. The process of EMT involves changes in cell morphology, architecture, adhesion and motility and is a crucial event in the acquisition of a more invasive and aggressive phenotype in many tumors. This study has been then designed in order to investigate OSM expression in vivo in hepatocellular carcinoma (HCC) and to investigate whether OSM may induce EMT in neoplastic liver cell lines. In a first series of analysis, OSM has been detected in vivo in HCC biopsies; in a subsequent series of experiments we then investigated in vitro whether recombinant human OSM was able to induce the acquisition of typical EMT-related mesenchymal features and increased invasiveness in a series cell lines. By performing invasion and chemotaxis assay in HepG2 , HuH7 and MDCK cells exposed to recombinant OSM all the cell lines showed an increased invasiveness and an increased migratory propensity. In addition, cells exposed to OSM underwent typical EMT morphological and cellular changes, scattered from cell clusters and acquired a spindle-shaped and fibroblast-like phenotype. Typical EMT changes detected involved: up-regulation of N-cadherin, vimentin, α-SMA and fibronectin expression as well as up- regulation of transcription factors like SNAI1, SNAI2 e TWIST which have been shown to operate as repressors of E-cadherin gene promoter. Moreover, our results also indicate that exposure of HepG2, HUH7 and MDCK cells to OSM up to 48 hours is followed by E-cadherin down-regulation and over-expression of α-smooth muscle actin (α-SMA). Concerning signaling pathways involved, data obtained suggest the involvement of two distinct major events: early events involving a ROS-mediated activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway and late events that involve the synthesis of polypeptide mediators and their release in the medium. Although available literature data suggest that OSM may result in VEGF synthesis and release in the medium through HIF-1 stabilization, our results seem to reasonably exclude a major involvement of VEGF in late EMT induction since OSM-related HepG2 invasiveness was not significantly modified by pre-treatment with a VEGFR2 neutralizing antibody or by a pharmacological inhibitor of the same receptor (SU1498). In conclusion, our results indicate that OSM seems to represent a stimulus able to induce typical morphological and molecular EMT changes and increased migration and invasiveness in neoplastic liver cells.

L'Oncostatina M (OSM), citochina appartenente alla famiglia dell'interleuchina 6 (IL-6), svolge un ruolo fondamentale in processi biologici quali l'infiammazione, lo sviluppo del fegato, la rigenerazione e la fibrogenesi epatica. Inoltre, la OSM risulta capace di indurre transizione epitelio-mesenchima (EMT) a livello dei tubuli prossimali renali. La transizione da cellule epiteliali a cellule mesenchimali richiede alterazioni per quanto concerne la morfologia, l'adesione e la motilità cellulare e rappresenta un meccanismo cruciale nell'acquisizione di un fenotipo maggiormente invasivo in molti tumori. Prendendo spunto da queste considerazioni, gli studi sperimentali presentati sono stati condotti allo scopo di verificare ove l'Oncostatina M sia espressa in vivo in campioni di tessuto di epatocarcinoma e sia capace di indurre EMT in linee cellulari neoplastiche di origine epatica. In primo luogo, mediante tecniche di immunoistochimica, è stata verificata l'espressione di OSM in vivo in biopsie umane di epatocarcinoma, in secondo luogo sono stati condotti esperimenti in vitro al fine di valutare ove l'OSM umana ricombinante sia capace di determinare la comparsa di marcatori fenotipici distintivi dell'EMT. Nelle cellule di epatoblastoma HepG2, ma anche nelle altre linee utilizzate come modello sperimentale (HuH7 ed MDCK) si è osservato, attraverso saggi di chemiotassi ed invasività, come il trattamento con OSM determini un aumento della capacità migratoria ed invasiva delle cellule, indice dell'acquisizione di un potenziale metastatico. Inoltre, in seguito al trattamento con OSM, le cellule si dissociano dai loro normali clusters ed assumono un fenotipo simil-fibroblastoide. Una condizione di EMT viene usualmente identificata mediante l'analisi di più marcatori caratteristici, quali: l'espressione della N-caderina, dell'α-SMA e della fibronectina, la localizzazione nucleare di β-catenina e l'incremento dell'espressione di fattori trascrizionali quali SNAI1 e SNAI2 che presentano la comune capacità di inibire il promotore del gene per E-caderina. In tutti i modelli sperimentali utilizzati è stato possibile osservare una significativa riduzione dell'espressione della E-caderina e un aumento dell'espressione dell'α-SMA a seguito del trattamento con OSM. Le vie di trasduzione del segnale coinvolte nell'induzione di EMT OSM-dipendente sono riconducibili a due distinte tipologie di eventi: eventi precoci che consistono in un'attivazione, mediata dai ROS, della via di segnale Wnt/β-catenina ed eventi tardivi riconducibili alla sintesi di mediatori polipeptidici ed al loro rilascio nel mezzo extracellulare. Dati di letteratura hanno descritto come l'OSM determini stabilizzazione di HIF-1 e conseguente sintesi e rilascio nel terreno di VEGF. Tuttavia, i dati ottenuti nelle condizioni sperimentali adottate sembrano escludere un coinvolgimento significativo del VEGF nell'induzione tardiva di EMT in quanto l'invasività delle HepG2 esposte ad OSM non è stata modificata significativamente dal pretrattamento con un anticorpo neutralizzante per il VEGFR2 o con un inibitore farmacologico dello stesso recettore (SU1498). In conclusione, i dati riportati in questa tesi indicano come l'Oncostatina M possa rappresentare uno stimolo in grado di determinare, in cellule tumorali di origine epatica, le tipiche alterazioni morfologiche e molecolari ed i comportamenti migratori ed invasivi compatibili con una tipica EMT.