The short-chain fatty acid butyrate, a metabolite naturally presents in human beings as a result of bacterial fermentation, is an inhibitor of histone deacetylase, thus able to regulate gene expression by modifying the acetylation status of nuclear histone proteins and non histone proteins. In vitro studies have shown that butyrate, in its conventional formulation of sodium salt (Na-but) is able to play a wide range of effects, including anti-tumor effect, suggesting its use as an anticancer drug. Nevertheless, in in vivo studies butyrate showed unfavourable pharmacokinetic properties, such as high plasmatic clearance and an important first-pass metabolism. In an attempt to overcome these limitations to its clinical use, researchers are exploring various delivery systems including butyric acid as cholesterybutyrate solid lipid nanoparticles (Chol-but). The aim of this study is to evaluate the effectiveness of butyrate as Chol-but compared to the conventional formulation of Na-but in two different human tumor cell lines, the HL-60, derived from acute promyelocytic leukemia and MCF7, derived from breast cancer, assessing the effects on cell growth, cell death mechanism, cell cycle, cellular uptake and gene expression. The cell growth of HL-60 and MCF7 was evaluated at increasing concentrations (0.01, 0.10, 0.50, 1.00mM) of Na-but and Chol-but at 24 and 48h. In HL-60 at 24h Cholbut treatment resulted in a reduction of 80% of cell growth compared to control cells and cells treated with Na-but at the same concentration. In MCF7 at 48h Chol-but and Na-but treatment at 1.00mM resulted in both a reduction of approximately 45% of cell growth compared with control. Moreover, in HL-60 was possible to highlight an important induction of apoptosis at 12h after treatment with Chol-but 0.50mM and a block in the G0/G1 phase of the cell cycle compared to control and cells treated with Na-but. By analyzing a series of genes involved in the mechanism of action of butyrate was possible to show a significant increase in the expression of CDKN1A gene, responsive to butyrate, following treatment with 0.50mM Chol-but at 12h and, in general, a different kinetics in gene transcription regulation with Na-but and Chol-but. In MCF7, at 1.00mM, it was not possible to highlight differences between Na-but and Chol-but level in induction of apoptosis and cell cycle, however, a slight increase in the expression of CDKN1A with both formulations was observed. We then highlight how Chol-but, in two different cell lines, leads to different outcomes with a greater effect than Na-but in HL-60 while, the vehicle is not able to potentiate the effect of butyrate in MCF7. Butyrate vehicoleted by SLN may result in change in rate of internalization and intracellular concentration according to the characteristics of the cell line investigated.
Il butirrato, un acido grasso a catena corta, è un metabolita fisiologicamente presente nell'uomo come risultato della fermentazione batterica ed è un inibitore delle istone deacetilasi, in grado quindi di regolare l'espressione genica modificando lo stato di acetilazione di proteine istoniche e non istoniche nucleari. Studi in vitro hanno dimostrato come il butirrato, nella sua formulazione convenzionale di sale sodico (Na-but) sia in grado di svolgere un ampio spettro di azioni tra cui quella anti-neoplastica, suggerendo il suo impiego come farmaco antitumorale. Nonostante ciò, studi in vivo si sono dimostrati deludenti a causa delle svantaggiose caratteristiche farmacocinetiche del butirrato, quali un'elevata clearance plasmatica ed un importante metabolismo di primo passaggio. Nel tentativo di superare questi limiti al suo uso clinico, sono in fase di studio diversi sistemi di veicolazione dell'acido butirrico tra i quali hanno suscitato particolare interesse le nanoparticelle solide lipidiche costituite da colesterilbutirrato (Chol-but). L'obiettivo del lavoro consiste nella valutazione dell'efficacia del butirrato veicolato come Chol-but rispetto alla formulazione convenzionale di Na-but in due diverse linee cellulari tumorali umane, le HL-60, derivate da una leucemia promielocitica acuta e le MCF7, derivate da un carcinoma mammario, valutandone gli effetti su crescita cellulare, meccanismo di morte cellulare, ciclo cellulare, uptake cellulare ed espressione genica. La crescita cellulare delle HL-60 e delle MCF7 è stata valutata a concentrazioni crescenti (0.01, 0.10, 0.50, 1.00mM) di Na-but e di Chol-but a 24h e 48h. Nelle HL-60 a 24h dal trattamento il Cholbut ha determinato una riduzione dell'80% della crescita cellulare rispetto al controllo e rispetto alle cellule trattate con Na-but alla stessa concentrazione. Nelle MCF7 a 48h dal trattamento, Chol-but e Na-but 1.00mM hanno determinato entrambi una riduzione di circa il 45% della crescita cellulare rispetto al controllo. Nelle HL-60 è stato possibile evidenziare un'importante induzione dell'apoptosi cellulare già a 12h dal trattamento con Chol-but 0.50mM ed un blocco in fase G0/G1 del ciclo cellulare rispetto al controllo e alle cellule trattate con Na-but. Analizzando una serie di geni coinvolti nel meccanismo d'azione del butirrato è stato possibile evidenziare un consistente aumento dell'espressione del gene CDKN1A, responsivo al butirrato, in seguito al trattamento con Chol-but 0.50mM a 12h ed in generale una diversa cinetica della regolazione della trascrizione genica nel trattamento con Na-but e Chol-but. Nelle MCF-7, alla concentrazione efficace, non è stato possibile evidenziare differenze tra Na-but e Chol-but a livello di induzione dell'apoptosi e ciclo cellulare evidenziando, comunque, un lieve aumento dell'espressione di CDKN1A con entrambe le formulazioni. E' possibile quindi evidenziare come la veicolazione del butirrato nelle due diverse linee cellulari abbia determinato esiti diversi con un effetto maggiore rispetto al Na-but nelle HL-60 mentre, la veicolazione non è riuscita a potenziare l'effetto del butirrato nelle MCF-7. Questo diverso comportamento ha indotto ad ipotizzare che la veicolazione del butirrato da parte delle SLN determini una modificazione della velocità di internalizzazione intracellulare e quindi di concentrazione, in base alle caratteristiche della linea cellulare indagata.
NANOPARTICELLE SOLIDE LIPIDICHE DI COLESTERILBUTIRRATO: VALUTAZIONE IN VITRO DELL'ATTIVITA' ANTITUMORALE
FOGLIETTA, FEDERICA
2010/2011
Abstract
Il butirrato, un acido grasso a catena corta, è un metabolita fisiologicamente presente nell'uomo come risultato della fermentazione batterica ed è un inibitore delle istone deacetilasi, in grado quindi di regolare l'espressione genica modificando lo stato di acetilazione di proteine istoniche e non istoniche nucleari. Studi in vitro hanno dimostrato come il butirrato, nella sua formulazione convenzionale di sale sodico (Na-but) sia in grado di svolgere un ampio spettro di azioni tra cui quella anti-neoplastica, suggerendo il suo impiego come farmaco antitumorale. Nonostante ciò, studi in vivo si sono dimostrati deludenti a causa delle svantaggiose caratteristiche farmacocinetiche del butirrato, quali un'elevata clearance plasmatica ed un importante metabolismo di primo passaggio. Nel tentativo di superare questi limiti al suo uso clinico, sono in fase di studio diversi sistemi di veicolazione dell'acido butirrico tra i quali hanno suscitato particolare interesse le nanoparticelle solide lipidiche costituite da colesterilbutirrato (Chol-but). L'obiettivo del lavoro consiste nella valutazione dell'efficacia del butirrato veicolato come Chol-but rispetto alla formulazione convenzionale di Na-but in due diverse linee cellulari tumorali umane, le HL-60, derivate da una leucemia promielocitica acuta e le MCF7, derivate da un carcinoma mammario, valutandone gli effetti su crescita cellulare, meccanismo di morte cellulare, ciclo cellulare, uptake cellulare ed espressione genica. La crescita cellulare delle HL-60 e delle MCF7 è stata valutata a concentrazioni crescenti (0.01, 0.10, 0.50, 1.00mM) di Na-but e di Chol-but a 24h e 48h. Nelle HL-60 a 24h dal trattamento il Cholbut ha determinato una riduzione dell'80% della crescita cellulare rispetto al controllo e rispetto alle cellule trattate con Na-but alla stessa concentrazione. Nelle MCF7 a 48h dal trattamento, Chol-but e Na-but 1.00mM hanno determinato entrambi una riduzione di circa il 45% della crescita cellulare rispetto al controllo. Nelle HL-60 è stato possibile evidenziare un'importante induzione dell'apoptosi cellulare già a 12h dal trattamento con Chol-but 0.50mM ed un blocco in fase G0/G1 del ciclo cellulare rispetto al controllo e alle cellule trattate con Na-but. Analizzando una serie di geni coinvolti nel meccanismo d'azione del butirrato è stato possibile evidenziare un consistente aumento dell'espressione del gene CDKN1A, responsivo al butirrato, in seguito al trattamento con Chol-but 0.50mM a 12h ed in generale una diversa cinetica della regolazione della trascrizione genica nel trattamento con Na-but e Chol-but. Nelle MCF-7, alla concentrazione efficace, non è stato possibile evidenziare differenze tra Na-but e Chol-but a livello di induzione dell'apoptosi e ciclo cellulare evidenziando, comunque, un lieve aumento dell'espressione di CDKN1A con entrambe le formulazioni. E' possibile quindi evidenziare come la veicolazione del butirrato nelle due diverse linee cellulari abbia determinato esiti diversi con un effetto maggiore rispetto al Na-but nelle HL-60 mentre, la veicolazione non è riuscita a potenziare l'effetto del butirrato nelle MCF-7. Questo diverso comportamento ha indotto ad ipotizzare che la veicolazione del butirrato da parte delle SLN determini una modificazione della velocità di internalizzazione intracellulare e quindi di concentrazione, in base alle caratteristiche della linea cellulare indagata.| File | Dimensione | Formato | |
|---|---|---|---|
|
302626_tesi_federica_foglietta.pdf
non disponibili
Tipologia:
Altro materiale allegato
Dimensione
1.42 MB
Formato
Adobe PDF
|
1.42 MB | Adobe PDF |
I documenti in UNITESI sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
https://hdl.handle.net/20.500.14240/116024