My thesis activity was based on the study of the anthocyanin biosynthetic pathway within a plant species belonging to the Solanaceae family, the eggplant: Solanum melongena L. Unfortunately the anthocyanins biosynthetic pathway in eggplant hasn't been completely elucidated yet, and some key genes involved in either regulatory or structural pathway still need to be studied and characterized. My work was firstly focused on the study of the anthocyanin biosynthetic pathways in Black Beauty: an eggplant variety particularly rich in anthocyanins. It was even object of this study Green Beauty, which was originated due to a spontaneous mutation (genetic or epigenetic) from the Black Beauty variety. This eggplant presents fruit similarity to the Black Beauty ones, except for the absence of purple pigmentation, that changes its colour into green. The first objective of my thesis work was to isolate, sequence and investigate the presence of mutations that eventually occurred in those genes responsible for the anthocyanin biosynthetic pathways within the two varieties (Green Beauty and Black Beauty) leading to a difference in the skin's colour. I focus my attention on two genes categories: the first one includes those genes involved in the regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway, the second one includes the structural genes directly involved in this biosynthesis. The first group of genes is composed of the transcription factors: Myb1, bHLH1, AN11 and TT8, while the second one includes the genes: ANS, DFR and CHS. The alignment of sequences (Myb1, bHLH1, AN11 and ANS) isolated from both varieties, showed no nucleotide differences between the complete or partial CDS. The second objective of my work was to study the transcriptional expression of the two group of genes involved in the anthocyanin biosynthesis not only in the previously mentioned varieties, but also in other eggplants cultivars chosen for their peculiar agronomical characteristics. Through a Real-Time PCR approach, this analysis elucidated how the structural genes involved in the anthocyanin biosynthetic pathways (DFR, ANS, CHS) were more expressed in those varieties characterized by purple fruits rather in the ones showing no pigmentation. On the other hand the genes involved in the regulation of this pathways displayed contrasting results. Finally, the third objective of this work, was aimed to functionally characterize the regulatory genes, and then to express them in vivo, in an heterologous system, such as the leaves of the model plant Nicotiana benthamiana. The chosen genes, Myb1, bHLH and WD40, are involved in the formation of ternary complex WBM, that is capable to interact with the DNA and therefore to stimulate the transcription of different metabolic pathway's structural genes, including those of the anthocyanins. For this purpose the Myb1, bHLH1 and AN11 genes, previously isolated from the Black Beauty variety, were inserted into the expression vector pEAQ-HT-DEST2 within Agrobacterium tumefaciens. Thanks to the agro-infiltration technique, the bacterial suspensions, containing Myb1, bHLH1 and AN11 genes, were infiltrated in different combination and optical densities, inside the Nicotiana benthamiana's leaves. The most interesting results were obtained using the Myb1 construct, since it led to an intense anthocyanin production in the agro-infiltrated areas.
La mia attività di tesi si è incentrata sullo studio della via biosintetica degli antociani all'interno di una specie vegetale appartenente alla famiglia delle Solanaceae, la melanzana: Solanum melongena L. In tale specie la via biosintetica degli antociani non è stata ancora del tutto delucidata, per tale ragione rappresenta un utile materiale per studi di espressione genica e caratterizzazione funzionale. Il mio lavoro si è focalizzato inizialmente sullo studio della via biosintetica degli antociani in una varietà di melanzana: la Black Beauty. È stata oggetto di studio anche la Green Beauty, originatasi per mutazione spontanea (genetica o epigenetica) a partire dalla Black Beauty. I frutti di questa pianta sono del tutto simili a quelli della Black Beauty tranne per l'assenza di pigmentazione viola, che rende verdi le melanzane prodotte. Il primo obiettivo del mio lavoro di tesi è stato quello di isolare, sequenziare e studiare la presenza di eventuali mutazioni nei geni responsabili della via biosintetica degli antociani nelle due varietà (Green Beauty e Black Beauty) associate ad una differenza nel colore dell'epicarpo dei frutti. I geni su cui mi sono focalizzata appartengono a due categorie: geni implicati nella regolazione del pathway di sintesi degli antociani e geni strutturali direttamente coinvolti nella biosintesi. Il primo gruppo di geni include i fattori di trascrizione: Myb1, bHLH1, AN11 e TT8, mentre il secondo gruppo include i geni: ANS, DFR e CHS. In seguito ad un'analisi di allineamento delle sequenze fra i geni isolati in entrambe le varietà (Myb1, bHLH1, AN11 e ANS), risulta che le CDS complete o parziali non presentano differenze a livello nucleotidico. Il secondo obiettivo del mio lavoro è stato quello di studiare l'espressione trascrizionale dei due gruppi di geni coinvolti nella biosintesi degli antociani, non solo nelle due varietà già citate, ma anche in altre diverse cultivar di melanzana, interessanti per le loro caratteristiche agronomiche. Attraverso un approccio Real-Time PCR, quest'analisi ha messo in luce come in generale i geni strutturali implicati nel pathway degli antociani (DFR, ANS; CHS) siano più espressi nelle varietà con frutto viola rispetto a quelle con assenza di pigmentazione. Risultati contrastanti sono invece emersi dall'analisi dei geni implicati nella regolazione di tale via. Infine il terzo obiettivo di questo lavoro, è rivolto a caratterizzare funzionalmente i geni regolatori e quindi esprimerli in vivo in un sistema eterologo quali sono le foglie della pianta modello Nicotiana benthamiana. I geni scelti, Myb1, bHLH e WD40, sono coinvolti nella formazione di un complesso ternario WBM in grado di interagire con il DNA e quindi di stimolare la trascrizione dei geni strutturali di diverse vie biosintetiche, tra cui quella degli antociani. A questo proposito i geni Myb1, bHLH1 e AN11, precedentemente isolati dalla varietà Black Beauty, sono stati inseriti in un vettore di espressione di tipo pEAQ-HT-DEST2 all'interno di Agrobacterium tumefaciens. Grazie alla tecnica di agro-infiltrazione le sospensioni batteriche contenenti i geni Myb1, bHLH1 e AN11 sono state infiltrate in diverse combinazioni e con diverse densità ottiche all'interno delle foglie di Nicotiana benthamiana. I risultati più interessanti sono emersi a seguito dell'agro-infiltrazione di Myb1, in quanto si è potuto osservare una produzione più o meno intensa di antociani nelle aree agro-infiltrate.
Isolamento, caratterizzazione funzionale e analisi trascrizionale dei geni associati alla biosintesi degli antociani in Solanum melongena L.
GUERRIERI, ALESSANDRA
2015/2016
Abstract
La mia attività di tesi si è incentrata sullo studio della via biosintetica degli antociani all'interno di una specie vegetale appartenente alla famiglia delle Solanaceae, la melanzana: Solanum melongena L. In tale specie la via biosintetica degli antociani non è stata ancora del tutto delucidata, per tale ragione rappresenta un utile materiale per studi di espressione genica e caratterizzazione funzionale. Il mio lavoro si è focalizzato inizialmente sullo studio della via biosintetica degli antociani in una varietà di melanzana: la Black Beauty. È stata oggetto di studio anche la Green Beauty, originatasi per mutazione spontanea (genetica o epigenetica) a partire dalla Black Beauty. I frutti di questa pianta sono del tutto simili a quelli della Black Beauty tranne per l'assenza di pigmentazione viola, che rende verdi le melanzane prodotte. Il primo obiettivo del mio lavoro di tesi è stato quello di isolare, sequenziare e studiare la presenza di eventuali mutazioni nei geni responsabili della via biosintetica degli antociani nelle due varietà (Green Beauty e Black Beauty) associate ad una differenza nel colore dell'epicarpo dei frutti. I geni su cui mi sono focalizzata appartengono a due categorie: geni implicati nella regolazione del pathway di sintesi degli antociani e geni strutturali direttamente coinvolti nella biosintesi. Il primo gruppo di geni include i fattori di trascrizione: Myb1, bHLH1, AN11 e TT8, mentre il secondo gruppo include i geni: ANS, DFR e CHS. In seguito ad un'analisi di allineamento delle sequenze fra i geni isolati in entrambe le varietà (Myb1, bHLH1, AN11 e ANS), risulta che le CDS complete o parziali non presentano differenze a livello nucleotidico. Il secondo obiettivo del mio lavoro è stato quello di studiare l'espressione trascrizionale dei due gruppi di geni coinvolti nella biosintesi degli antociani, non solo nelle due varietà già citate, ma anche in altre diverse cultivar di melanzana, interessanti per le loro caratteristiche agronomiche. Attraverso un approccio Real-Time PCR, quest'analisi ha messo in luce come in generale i geni strutturali implicati nel pathway degli antociani (DFR, ANS; CHS) siano più espressi nelle varietà con frutto viola rispetto a quelle con assenza di pigmentazione. Risultati contrastanti sono invece emersi dall'analisi dei geni implicati nella regolazione di tale via. Infine il terzo obiettivo di questo lavoro, è rivolto a caratterizzare funzionalmente i geni regolatori e quindi esprimerli in vivo in un sistema eterologo quali sono le foglie della pianta modello Nicotiana benthamiana. I geni scelti, Myb1, bHLH e WD40, sono coinvolti nella formazione di un complesso ternario WBM in grado di interagire con il DNA e quindi di stimolare la trascrizione dei geni strutturali di diverse vie biosintetiche, tra cui quella degli antociani. A questo proposito i geni Myb1, bHLH1 e AN11, precedentemente isolati dalla varietà Black Beauty, sono stati inseriti in un vettore di espressione di tipo pEAQ-HT-DEST2 all'interno di Agrobacterium tumefaciens. Grazie alla tecnica di agro-infiltrazione le sospensioni batteriche contenenti i geni Myb1, bHLH1 e AN11 sono state infiltrate in diverse combinazioni e con diverse densità ottiche all'interno delle foglie di Nicotiana benthamiana. I risultati più interessanti sono emersi a seguito dell'agro-infiltrazione di Myb1, in quanto si è potuto osservare una produzione più o meno intensa di antociani nelle aree agro-infiltrate.| File | Dimensione | Formato | |
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