Applicazione della spettroscopia di dicroismo circolare allo studio di addotti proteici con substrati di interesse farmacologico

L'utilizzo della spettroscopia CD per lo studio di variazioni conformazionali in macromolecole biologiche si focalizza normalmente sulla regione del Lontano-UV: gli assorbimenti localizzati in questa regione spettrale sono direttamente correlabili alla struttura secondaria. La deconvoluzione degli spettri CD nella regione del Lontano-UV è resa possibile dalla disponibilità di algoritmi di calcolo, fondati su una base teorica consolidata, che consentono di ottenere la stima del contenuto delle diverse componenti di struttura secondaria che contribuiscono ad una traccia spettrale. L'analisi degli spettri nella regione del Vicino-UV, che contiene informazioni relative alle interazioni terziarie, e del Visibile, che contiene informazioni sull'intorno dei cromofori, è resa più difficoltosa dall'assenza di trattazioni quantitative rigorose ed infatti normalmente si limita a considerazioni di natura qualitativa. L'esame della letteratura disponibile mostra una certa carenza di lavori nei quali si tenti un utilizzo quantitativo del dicroismo circolare nel Vicino-UV/Vis per lo studio delle modificazioni della struttura terziaria di macromolecole. Uno degli obiettivi di questo lavoro di tesi è stato quello di utilizzare la spettroscopia CD nelle regioni del Vicino-UV/Vis per investigare il comportamento di sistemi proteici soggetti a variazioni conformazionali a seguito di fattori esterni. In particolare, abbiamo preso in esame gli addotti dell'enzima lattoperossidasi da latte bovino con tre tipologie di substrati, caratterizzati dal possedere distinte modalità di interazione con il substrato e siti di binding differenti: SCN- (che accede alla tasca dell'eme), le piccole molecole organiche DHBA, DHPP, INH (che accedono ad un sito di binding nelle vicinanze dell'eme stesso detto canale dei substrati) e i substrati organici voluminosi ABTS, Mitoxantrone, Ellipticina, Doxorubicina (che a causa del proprio ingombro sterico si limitano ad aderire alla superficie della proteina). Di tutti questi addotti sono stati registrati gli spettri CD nel Lontano e Vicino UV-Vis ed abbiamo verificato la presenza di modificazioni delle interazioni secondarie e terziarie della proteina in seguito al binding dei substrati e l'influenza dei medesimi sulla stabilità degli addotti. Abbiamo verificato che substrati come il SCN- non determinano apprezzabili variazioni della struttura secondaria né di quella terziaria dell'enzima; INH, DHBA e DHPP hanno effetti distinti, in relazione alla tipologia di gruppi funzionali presenti nella loro struttura. Tutti e tre i substrati determinano variazioni, più o meno marcate, della struttura terziaria nella regione relativa al canale idrofobico; in certi casi, queste modificazioni interessano anche l'intorno dell'eme. ABTS, MTX, ELL e DOX hanno effetti differenziati sui due tipi di interazioni, correlabili a proprietà molecolari quali la rigidità strutturale e la presenza di estese porzioni idrofobiche, capaci di interagire con gli aminoacidi aromatici esposti sulla superficie della proteina. Abbiamo infine dimostrato che l'addotto LPO/Ellipticina è nettamente più resistente alla denaturazione chimica rispetto alla sola proteina LPO. Questo dato è molto significativo sul piano fisiologico, in quanto le interazioni proteina-legante sono alla base della regolazione metabolica, e dimostra l'opportunità di utilizzare la spettroscopia CD quale strumento privilegiato e di facile utilizzo per l'ottenimento di queste informazioni.