Effetto dei polimorfismi sull'attività dell'aromatasi in cellule proneuronali ST14A

L'aromatasi è un enzima conosciuto e ben caratterizzato che appartiene alla superfamiglia proteica dei citocromi P450. Questo enzima catalizza l'ultimo passaggio della sintesi degli estrogeni a partire dagli androgeni (in particolare converte rispettivamente androstenedione, testosterone e 17α-idrossitestosterone in estrone, estradiolo e estriolo). Molti studi hanno dimostrato un ruolo neuroprotettivo di questo enzima nel cervello. Inoltre, la presenza di mutazioni puntiforme polimorfiche (SNPs) nella sequenza codificante, come ad esempio R264C and R264H, è stata associata ad un elevato rischio d'insorgenza della malattia di Alzheimer. L'obiettivo di questo studio e quello di studiare l'attività del gene nativo dell'aromatasi (WT) e delle due varianti polimorfiche R264C e R264H nelle ST14A, cellule nuronali di ratto. Le due varianti polimorfiche sono state generate attraverso una mutagenesi sito-diretta sul plasmide pCMV6-XL4 contenete la sequenza codificante per l'aromatasi e usate per trasfettare le cellule eucariote. Inoltre, è stato generato un vettore vuoto usato come controllo negativo. Per verificare l'efficienza di trasfezione e la quantità di aromatasi WT e delle due varianti è stato necessario utilizzare un'analisi in Western Blot. L'attività dell'aromatasi è stata misurata attraverso un ELISA competitivo che è stato normalizzato per il numero di proteine totali che ha dimostrato che l'attività non mostra differenze in cellule trasfettate con l'aromatasi WT rispetto a quella misurata nelle varianti polimorfiche R264C e R264H. Tuttavia l'attività delle tre proteine diminuisce in modo diverso durante il tempo, suggerendo che modificazioni post-traduzionali ne regolino l'attività o che abbiano una diversa stabilità. Per verificare la prima ipotesi, il saggio di attività è stato eseguito in presenza di H89, inibittore selettivo per la PKA. I risultati mostrano che l'attività della R264C e della R264H è parzialmente ripristinata in presenza di H89. In conclusione, i dati confermano che l'attività dell'aromatasi è regolata dalla fosforilazione e che il polimorfismo nella sequenza consenso per la fosforilazione influisce sull'attività della proteina e sui livelli di estrogeni. Dal momento che gli estrogeni cerebrali hanno una funzione neuroprotettiva, questi dati confermano che potrebbe esserci una correlazione tra queste SNPs e l'insorgenza di malattie neurodegenerative.

Aromatase is a well-known and characterized enzyme belonging to the cytochromes P450 superfamily. It catalyses the last step of estrogen biosynthesis from androgens (specifically, it converts androstenedione, testosterone and 17-hydroxytestosterone into estrone, estradiol and estriol respectively). Many studies have established a neuroprotective role of the enzyme in the brain. Moreover, single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the coding sequence, such as R264C and R264H, have been associated to an increased risk for Alzheimer's disease. The aim of this work was to study the activity of full-length aromatase wild type (WT) and the two polymorphic variants R264C and R264H in neuronal ST14A rat cells. The two variants were generated by site-directed mutagenesis applied on the pCMV6-XL4 plasmid carrying the gene coding for aromatase and used for eukaryotic cell transfection. An empty vector, to be used as negative control, was also generated. Western blot analysis was performed to check transfection efficiency and to compare the amounts of WT and the variants. Aromatase activity, measured by direct competitive ELISA and normalized to total proteins concentration, shows no significant differences between the activities of WT and the polymorphic variants R264C and R264H. However, the activity of the three proteins decreases in a different extent during time, suggesting that post-translational modifications regulate their activity or that they have a different stability. To check the first hypothesis, the activity assay was performed in the presence of H89, a selective inhibitor of PKA. The results show that the activity of R264C and R264H is partially restored in the presence of H89. In conclusion, the data confirm that aromatase activity is regulated by phosphorylation and that polymorphism in the consensus region for phosphorylation can affect the protein activity and estrogens levels. Since brain estrogens are neuroprotective, these findings confirm that there can be a correlation between such SNPs and the onset of neurodegenerative disorders.