ANALISI DELL'INTERAZIONE TRA LA PROTEINA INTERFERON INDUCIBILE IFI16 E LA PROTEINA VIRALE DEL TEGUMENTO pp65 DURANTE L'INFEZIONE DEL CITOMEGALOVIRUS UMANO

A key player in the intrinsic resistance against human cytomegalovirus (HCMV) is the interferon-γ-inducible protein 16 (IFI16), a member of the PYHIN family, that modulates various cellular and viral functions. We have recently demonstrated that IFI16 behaves as a viral DNA sensor in the first hours post infection and as a repressor of viral gene transcription in the later stages. However, as a viral countermeasure to the IFI16 restriction function, the viral protein kinase pUL97 regulates the phosphorylation and the nuclear export of IFI16 into the cytoplasmic viral assembly complex (vAC). Based on these observations, the aim of the present study was to gain more insight into the molecular mechanisms used by HCMV to evade the antiviral function of IFI16; above all we focused on the tegument viral protein pp65 (pUL83). Our experimental model consists of primary human foreskin fibroblast (HFF) infected with HCMV unable to express UL83 encoded pp65 (v65Stop), and the corresponding revertant virus (v65Rev). The results of our investigations demonstrated that IFI16 is stabilized by its interaction with pp65 at late time points of HCMV infection, which stood in contrast to IFI16 degradation, observed in herpes simplex virus (HSV-1)¿infected cells. We also demonstrated the requirement of pp65, together with pUL97, for the translocation of IFI16 into the cytoplasm; this experiment were performed using the viral mutant RV-VM1, expressing a nuclearly retented pp65. Thus, these data reveal a dual role for pp65: i) pp65 delocalizes IFI16 from the nucleus into the cytoplasm during HCMV replication; ii) pp65 stabilizes and protects IFI16 from proteolytic degradation.

Una proteina fondamentale nella resistenza intrinseca contro il citomegalovirus umano (HCMV) è la proteina interferon-γ-inducibile 16 (IFI16), appartenente alla famiglia delle proteine PYHIN, che presenta numerose funzioni a livello cellulare (antiproliferative, pro-infiammatorie, pro-apoptotiche). Studi recenti condotti nel laboratorio dove ho svolto il mio progetto di Tesi hanno dimostrato che IFI16 agisce come sensore del DNA virale di HCMV nelle prime ore di infezione e come soppressore della trascrizione dei geni virali negli stadi più tardivi. Viceversa, HCMV ha evoluto meccanismi per evadere dall'attività antivirale di IFI16, attraverso la chinasi virale pUL97, che fosforila IFI16 e in seguito la trasloca nel citoplasma delle cellule infettate. Sulla base di queste premesse, obiettivo del presente lavoro di Tesi è stato analizzare in maniera più approfondita i meccanismi molecolari alla base del processo di evasione di HCMV dall'attività antivirale di IFI16, focalizzandoci in modo particolare su una proteina virale del tegumento chiamata pp65 (pUL83), che è noto possedere attività immunosoppressiva. Come modello di studio abbiamo utilizzato fibroblasti primari ottenuti da prepuzio (¿Human Foreskin Fibroblasts¿, HFF), infettati con un ceppo di HCMV deleto per pp65 (v65Stop) e con il corrispondente virus revertante (v65Rev). Gli esperimenti eseguiti ci hanno permesso di dimostrare che pp65, interagendo con IFI16, è in grado, in stadi tardivi dell'infezione di HCMV di stabilizzarla, contrariamente all'herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1), il quale tende a degradarla. Abbiamo inoltre dimostrato che pp65, oltre a pUL97, è necessaria per la traslocazione di IFI16 nel citoplasma, utilizzando, per questi specifici esperimenti, il ceppo mutato di HCMV denominato RV-VM1, il quale esprime una forma di pp65 incapace di traslocare nel citoplasma. Complessivamente, questi dati rivelano una doppia funzione di pp65: 1) pp65 delocalizza IFI16 dal nucleo al citoplasma nelle fasi tardive della replicazione di HCMV; 2) pp65 stabilizza IFI16 proteggendola dalla degradazione proteolitica.