Segnali di calcio in un modello di cellule neuroendocrine immortalizzate

Il lavoro sperimentale descritto in questa tesi è focalizzato sull'analisi dei meccanismi responsabili dei segnali di calcio osservati in un modello di cellule neuroendocrine immortalizzate, le cellule GN11. Queste cellule sono state ottenute per tumorigenesi mirata in topi transgenici e rappresentano un buon modello sperimentale per lo studio dei neuroni GnRH. Il sistema GnRH, conosciuto anche come sistema LHRH, svolge un ruolo essenziale nelle funzioni riproduttive dei vertebrati. Il suo sviluppo è caratterizzato da un peculiare processo migratorio la cui perturbazione può portare a patologie che hanno un profondo impatto sulla fertilità. Il calcio svolge un ruolo chiave, come secondo messaggero principale, nel controllo della motilità cellulare. Nel caso dei neuroni GnRH è stato evidenziato che la loro migrazione dipende dalla presenza di calcio extracellulare, ma i segnali di Ca2+ registrati nelle cellule migranti sarebbero legati solo parzialmente all'espressione di canali voltaggio-dipendenti permeabili a questo ione. Questo suggerisce l'esistenza di altri meccanismi responsabili del suo ingresso all'interno di questi neuroni. In una sottopopolazione di cellule GN11 sono stati registrati transienti spontanei di Ca2+. Queste cellule non possiedono canali voltaggio-dipendenti per il Ca2+ e non è stata dimostrata la presenza di recettori NMDA, generalmente associati alla dipendenza da Ca2+ nella migrazione neuronale. Di conseguenza, nelle cellule GN11 questi transienti e il comportamento migratorio che essi controllano devono dipendere da altre classi di canali permeabili al calcio. I canali TRPC rappresentano un probabile candidato in quanto sono presenti nei neuroni GnRH maturi e sono coinvolti in diversi esempi di migrazione di cellule non neuronali. Inoltre, nelle cellule GN11 è stata recentemente dimostrata l'espressione di alcuni membri della sottofamiglia dei canali TRPC, in particolare delle proteine TRPC1, TRPC2 e TRPC5. L'obiettivo di questo lavoro sperimentale è stato quello di studiare il coinvolgimento di questi canali nei transienti di calcio delle cellule GN11 attraverso la realizzazione di esperimenti di calcium imaging e operando sia in Tyrode standard, sia in presenza di un motogeno, l'FCS. Dopo una preliminare osservazione che la migrazione di queste cellule è inibita in assenza di calcio extracellulare, confermandone il ruolo nella motilità che le caratterizza, sono stati utilizzati dei bloccanti dei canali voltaggio-dipendenti per escludere la presenza di questa tipologia di canali. Successivamente, il lavoro si è concentrato sull'analisi dell'effetto sulle oscillazioni di calcio da parte di noti antagonisti e agonisti dei canali TRPC, in particolare SKF-96365, 2-APB, La3+ e OAG; inoltre, considerando l'elevata espressione di trascritti di TRPC1 in queste cellule, valutata in precedenza attraverso PCR quantitativa, ci si è avvalsi di un anticorpo specifico in grado di riconoscere questa subunità. Attraverso questo approccio è stato possibile verificare il coinvolgimento dei canali TRPC nei segnali di Ca2+ osservati in questa popolazione neuronale.