Impatto del DNMT3B cataliticamente inattivo sul mesoderma parassiale. ​

DNA methylation as a main epigenetic modification plays a vital role in normal development and disease. DNA methyltransferases (DNMTs) including DNMT1 and DNMT3s (DNMT3A and 3B) enzymes generate and maintain CpG methylation across the genome. Our study aims to find the effect of the inactively catalytic domain of DNMT3B on the paraxial mesoderm, mainly lineage markers and its phenotypic features, upon inactivation of this domain using the CRISPR/Cas9 system. For this purpose, we prepared DNMT3B catalytic knockout (CatKO) in H9 human embryonic stem cells (hESCs) to remove the domain and leave other parts of the protein. Using the GSK3 Inhibitor/WNT Activator, we differentiated control H9 cells in parallel with H9-CatKO cells toward the paraxial mesoderm. We performed RNA sequencing on the paraxial mesoderm stage to investigate the differential expression of lineage markers. We monitored the phenotypic characteristics of the cells in stem cell and mesoderm stages. Our results revealed that among 150 lineage marker genes, 11 were differentially expressed in H9 in catalytically inactive DNMT3B H9 compared to control H9, four were upregulated and seven were downregulated. These markers were related to specific markers of mesoderm and ectoderm and markers of mixed lineages. However, there were no RNA expression changes for particular markers of the trophectoderm. Among the upregulated genes, only the Nestin gene has transcription factor binding sites for DNMT3B. This indicates that the altered expression of this gene may be directly linked with the catalytically inactive DNMT3B. Gene set enrichment analysis (GSEA) for differentially expressed lineage markers showed that several biological processes could be negatively or positively regulated upon their altered expression. While several differentially expressed lineage markers were found in the paraxial mesoderm stage, the cell phenotypes did not show changes between control H9 and the catalytically inactive DNMT3B. Therefore, the differentiation toward other stages could reveal the essential role of this catalytic domain of DNMT3B on different biological pathways and phenotypic features of differentiated cells.

La metilazione del DNA come principale modificazione epigenetica svolge un ruolo vitale nel normale sviluppo e nella malattia. Le DNA metiltransferasi (DNMT), inclusi gli enzimi DNMT1 e DNMT3 (DNMT3A e 3B), generano e mantengono la metilazione CpG attraverso il genoma. Il nostro studio mira a trovare l'effetto del dominio inattivamente catalitico di DNMT3B sul mesoderma parassiale, principalmente marcatori di lignaggio e le sue caratteristiche fenotipiche, dopo l'inattivazione di questo dominio utilizzando il sistema CRISPR/Cas9. A questo scopo, abbiamo preparato il knockout catalitico DNMT3B (CatKO) nelle cellule staminali embrionali umane H9 (hESC) per rimuovere il dominio e lasciare altre parti della proteina. Utilizzando l'inibitore GSK3/attivatore WNT, abbiamo differenziato le cellule H9 di controllo in parallelo con le cellule H9-CatKO verso il mesoderma parassiale. Abbiamo eseguito il sequenziamento dell'RNA sullo stadio del mesoderma parassiale per studiare l'espressione differenziale dei marcatori del lignaggio. Abbiamo monitorato le caratteristiche fenotipiche delle cellule negli stadi di cellule staminali e mesoderma. I nostri risultati hanno rivelato che tra 150 geni marcatori di lignaggio, 11 erano espressi in modo differenziale in H9 in DNMT3B H9 cataliticamente inattivo rispetto al controllo H9, quattro erano sovraregolati e sette erano sottoregolati. Questi marcatori erano correlati a marcatori specifici del mesoderma e dell'ectoderma e a marcatori di lignaggi misti. Tuttavia, non sono stati riscontrati cambiamenti nell'espressione dell'RNA per particolari marcatori del trofettoderma. Tra i geni sovraregolati, solo il gene Nestin ha siti di legame del fattore di trascrizione per DNMT3B. Ciò indica che l'espressione alterata di questo gene può essere direttamente collegata al DNMT3B cataliticamente inattivo. L'analisi di arricchimento del set genetico (GSEA) per marcatori di lignaggio espressi in modo differenziale ha mostrato che diversi processi biologici potrebbero essere regolati negativamente o positivamente in base alla loro espressione alterata. Sebbene siano stati trovati diversi marcatori di lignaggio espressi in modo differenziale nello stadio del mesoderma parassiale, i fenotipi cellulari non hanno mostrato cambiamenti tra il controllo H9 e il DNMT3B cataliticamente inattivo. Pertanto, la differenziazione verso altri stadi potrebbe rivelare il ruolo essenziale di questo dominio catalitico di DNMT3B su diversi percorsi biologici e caratteristiche fenotipiche di cellule differenziate.