Caratterizzazione spettroscopica e calorimetrica dell’interazione di interferenti endocrini con l’enzima aromatasi

Human aromatase (cytochrome P450 19A1) is a key enzyme in estrogen biosynthesis that catalyse the conversion of androgens into estrogens throughout the aromatization of the A-ring of the androgen steroid scaffold. Since the physiological endocrine system equilibrium has impact in several diseases such as estrogen receptor positive (ER+) breast cancer, extensive research has been conducted on aromatase inhibitors (AI). The thesis project aimed to characterize, through spectroscopic and calorimetric techniques, the binding to HA of pesticides known to partially inhibit its activity and therefore act as endocrine disruptive chemicals (EDCs). Recombinant human aromatase overexpression from E. coli DH5α competent cell-line and subsequent purification by ion and affinity chromatography was achieved. Starting from the previously screened list of pesticides, imazamox and metolachlor were selected to be analysed. Firstly, to assess possible inhibitory activity the pesticides were assayed with Uv/Vis spectroscopic following the spectroscopic shift of the characteristic Soret band. Subsequently, MicroCal ITC (Isothermal Titration Calorimetry) was employed to obtain the thermodynamic parameters of binding while X-Band CW EPR (Electron Paramagnetic Resonance) spectroscopy was applied to clarify the nature of the interaction with the heme prosthetic group of HA. The calorimetric analysis showed that imazamox binds exothermically to aromatase; from spectroscopic titration was recorded a 4 nm red shift of the Soret peak, and from the g factor analysis of the CW EPR spectrum was concluded that imazamox directly coordinates the ferric heme iron. In contrast, metolachlor mainly showed an endothermic binding, a small type I spectroscopic shift, and fewer changes in the CW EPR spectrum. This suggested that metolachlor inhibits aromatase through an allosteric mechanism. At last were predicted the kinetic dissociation constants for both pesticides and using Autodock4, were calculated probable binding poses. All results were compared to previously published literature.

L'aromatasi umana (citocromo P450 19A1) è un enzima coinvolto nella biosintesi degli estrogeni che, attraverso l'aromatizzazione dell'anello A dello scheletro steroideo, catalizza la conversione di androgeni in estrogeni. Dal momento che gli equilibri ormonali hanno un predominante impatto su diverse malattie, come ad esempio sul cancro al seno (ER+ breast cancer), sono state condotte approfondite ricerche sull’inibizione dell’aromatasi. Il progetto di tesi mira a caratterizzare attraverso tecniche spettroscopiche e calorimetriche la natura del legame dell'aromatasi umana con pesticidi noti per inibirne parzialmente l’attività, agendo quindi come interferenti endocrini. Partendo dalla sovraespressione dell'aromatasi umana da una linea cellulare competente (E. coli DH5α) è stata effettuata la successiva purificazione dell’enzima tramite cromatografia ionica e di affinità. Dalla lista di pesticidi selezionati sono stati scelti imazamox e metolachlor per essere analizzati. Inizialmente, l’iterazione dei pesticidi con l’enzima aromatasi è stata studiata attraverso spettroscopia UV/Vis seguendo lo spostamento in lunghezza d’onda della caratteristica banda di Soret. Successivamente, sono stati ottenuti i parametri termodinamici di legame attraverso la titolazione del pesticida in condizioni isoterme (MicroCal ITC), mentre è stata impiegata la spettroscopia a risonanza paramagnetica elettronica in onda continua (CW EPR) per chiarire la natura dell'interazione con il gruppo prostetico eme dell’aromatasi. L'analisi calorimetrica ha mostrato che l'imazamox si lega all'aromatasi attraverso un processo esotermico; dalla titolazione spettroscopica è stato registrato uno spostamento batocromico di 4 nm del picco di Soret e dall'analisi del fattore g dello spettro EPR è stato concluso che l'imazamox coordina direttamente il ferro emico. Diversamente, il metolachlor interagisce con l’enzima attraverso un processo endotermico, mostra un piccolo spostamento spettroscopico di tipo I e minori cambiamenti nello spettro EPR a onda continua. Questi risultati suggeriscono che il metolachlor inibisca l'aromatasi attraverso un meccanismo allosterico. Infine, sono state stimate le costanti di dissociazione di entrambi i pesticidi ed utilizzando Autodock4, ne sono state calcolate le probabili pose di legame. Tutti i risultati sono stati confrontati con la letteratura pubblicata precedentemente.