VALIDAZIONE IN VITRO E IN VIVO DI SONDE FLUORESCENTI PER IL TARGETING DELLA PROTEINA ASSOCIATA AI FIBROBLASTI (FAP)

Fibroblast activation protein (FAP) is a transmembrane protein belonging to the dipeptidyl peptidase (DPP) family, mostly absent in healthy tissues but overexpressed in pathological tissues. In particular, FAP is expressed by CAFs (Cancer Associated Fibroblasts) in nearly 90% of solid tumors for which it is considered a tumor marker of great interest. Its overexpression in cancer-associated fibroblasts has been used for targeting by inhibitors (FAPI), both for therapeutic and diagnostic purposes. This thesis project aims to develop and validate in vitro and in vivo near-infrared fluorescent (NIRF) probes by conjugating the FAP-inhibitor FAPI-46, widely used as a diagnostic agent in nuclear medicine for PET (Positron Emission Tomography) and three different cyanines, IRDye800CW, FNIRTag and s77z. These three fluorescent molecules were selected because of the different net charge (IRDye800CW has net charge -3 while the other two are zwitterionic) and the different binding at the C4' position (s775z does not exhibit C-O binding like the other two but C-C). For the synthetic procedure, a simple amide conjugation by activated carboxyl group as NHS ester was used. After purification, characterization was carried out by UPLC-MS, UV/Visible spectrophotometry and Fluorescence techniques. Following quantification by Lamber-Beer's law (conjugation is assumed not to have drastically changed the molar extinction coefficient of unconjugated cyanines), absorption and fluorescence profiles (emission and excitation) at different concentrations were evaluated to compare fluorescence. Fluorescent compounds photostability was evaluated following irradiation because literature data show that the polyene of the fluorescent probe structure can undergo degradation by molecular oxygen. Another substantial difference between the three fluorescent molecules to which the FAP-inhibitor FAPI-46 was chosen to be conjugated is the different tendency to form small nonfluorescent aggregates and bind albumin. For this reason, binding with human serum albumin was evaluated in vitro monitoring the maximum fluorescence emission proper to each fluorophore. In order to evaluate the in vitro uptake of the developed probes, a cell line genetically modified to express FAP (HEK293) was used to determine whether conjugation could result in a change in FAP protein recognition in vitro. In addition, TUBO mammary carcinoma cells were inoculated subcutaneously into BALB/c mice for preliminary evaluation ex vivo of FAP expression on explanted tumors by flow cytometry measurements and ex vivo immunohistochemical staining. Finally, with the intent to validate the FAPI-IRDye800CW and FAPI-FNIR-Tag probes at the preclinical level, TUBO tumor cells were inoculated subcutaneously into athymic mice (nude mice), on which in vivo fluorescence imaging and, after tumor explantation, ex vivo biodistribution measurements were performed.

La proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP) è una proteina transmembrana appartenente alla famiglia delle dipeptidil peptidasi (DPP), per lo più assente nei tessuti sani ma sovra-espressa in quelli patologici. In particolare, FAP è espressa dai CAFs (Fibroblasti Associati al Cancro) in quasi il 90% dei tumori solidi, per cui è considerato un marcatore tumorale di grande interesse. La sua sovra-espressione nei fibroblasti associati al cancro è stata impiegata per il targeting da parte di inibitori (FAPI), sia a scopo terapeutico che diagnostico. Questo progetto di tesi si propone di sviluppare e validare in vitro e in vivo delle sonde fluorescenti nel vicino infrarosso (NIRF) attraverso la coniugazione del FAP-inibitore FAPI-46, ampiamente utilizzato come agente diagnostico in medicina nucleare per PET (Tomografia a Emissione di Positroni) e tre differenti cianine, IRDye800CW, FNIR-Tag e s775z. Queste tre molecole fluorescenti sono state selezionate in virtù della differenza di carica (IRDye800CW ha carica netta -3, mentre le altre due sono zwitterioniche) e del differente legame in posizione C4’ (s775z non presenta legame C-O come le altre due, ma C-C). Per la procedura sintetica, è stata utilizzata una semplice coniugazione amidica mediante gruppo carbossilico attivato come estere NHS. Dopo la purificazione, è stata effettuata la caratterizzazione mediante tecniche di UPLC-MS, spettrofotometria UV/Visibile e di Fluorescenza. In seguito alla quantificazione mediante la legge di Lamber-Beer (si suppone che la coniugazione non abbia drasticamente modificato il coefficiente di estinzione molare delle cianine non coniugate), sono stati valutati i profili di assorbimento e di fluorescenza (emissione ed eccitazione) a diverse concentrazioni, al fine di confrontarne la fluorescenza. I tre composti sono stati valutati dal punto di vista della fotostabilità in seguito all’irraggiamento poiché i dati di letteratura dimostrano che il poliene della struttura della sonda fluorescente può subire una degradazione ad opera dell’ossigeno molecolare. Un’altra differenza sostanziale tra le tre molecole fluorescenti a cui si è scelto di coniugare il FAP-inibitore simil-FAPI-46 è la differente tendenza a formare piccoli aggregati non fluorescenti e a legare l’albumina. Per tale ragione, è stato valutato in vitro il binding con l’albumina sierica umana, andando a titolare il composto fluorescente con concentrazioni crescenti di albumina, monitorando il massimo di emissione di fluorescenza proprio di ciascun fluoroforo. Al fine di valutare l’uptake in vitro delle sonde sviluppate, è stata impiegata una linea cellulare geneticamente modificata per esprimere FAP (HEK293) per determinare se la coniugazione potesse aver comportato una modifica nel riconoscimento della proteina FAP in vitro. Inoltre, le cellule di carcinoma mammario TUBO sono state inoculate sottocute in topi BALB/c per una valutazione preliminare dell’espressione di FAP sui tumori espiantati, mediante misure di citometria a flusso e colorazioni immunoistochimiche ex vivo. Infine, con l’intento di validare a livello preclinico le sonde FAPI-IRDye800CW e FAPI-FNIR-Tag, le cellule tumorali TUBO sono state inoculate sottocute in topi atimici (nude mice), sui quali sono state effettuate misure di imaging di fluorescenza in vivo e, dopo l’espiantazione del tumore, di biodistribuzione ex vivo.