Inflammatory Bowel Diseases (IBD) are autoimmune disorders which often require immunosuppressive treatment to maintain a long-term symptoms remission.The immunosuppressors used for treatment are the thiopurine drugs 6-mercaptopurine (6-MP) and azathioprine (AZA, prodrug of 6-MP). In fact, previous studies highlighted how the efficacy and the onset of adverse events in related to pharmacokinetic and pharmacogenetic aspects. Considering pharmacokinetics, the concentration of AZA metabolites (6-TG) and (6-MMP) in red blood cells had been related to both treatment efficacy and toxicity. Nevertheless, nothing was known about the concentrations in their target cells: the lymphocytes. Conversely, among the phamacogenetic factors,are represented by the polymorphisms of the gene coding for (TPMT), an enzyme involved in the metylation of 6-MP to 6-MMP. So, the primary aim of this work has been the development of chromatographic method to quantify 6-TG-riboside (6-TGr) and 6-MMP-riboside (6-MMPr) and their nucleotides in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs): lymphocytes and monocytes. The secondary aim is the evaluation of these metabolites concentration in real samples from patients in maintenance therapy with AZA, and of the impact of the main TPMT gene polymorphisms (TPMT *2, *3A, 3*B and *3C) on these concentrations. 6-TGr and 6-MMPr quantification in nucleosidic and nucleotidic form was performed through a enzymatic de-phosphorilation protocol (with acid phosphatase), followed by analysis with (UPLC-MS/MS system). PBMC isolation was obtain through the use of CPT vacuteiners. Genotyping was performed through PCR and RFLP techniques. Considering pharmacokinetic analysis, a large fraction (84% ca.) of the 2 metabolites was observed in phosphorylated (nucleotidic) form. The genotyping evidenced the presence of only 2 eterozygotes who carried the *3A TPMT variant: other 41 patients were *1/ *1 homozygotes. Wild-type homozygotes had an unbalanced ratio in favor of 6-TGr compared with eterozygotes, however this difference resulted not significant.Conversely, a statistically significant difference was observed between females and males: in our population a lower concentration of total 6-TGr resulted in females (Pvalue 0.05) as compared to males. No significant difference was observed for total 6-MMPr concentrations. The observed differences in the intra-PBMC concentrations of total 6-TGr could be due to 2 different mechanisms: 1) a stronger penetration of 6-MP (differences in transport) or a lower activity of TPMT (difference in metabolism) in PBMCs of male patients.In conclusion, reported results from this study suggest the existence of a wide variability in intra-PBMC concentration of the main metabolites of AZA. The presence of TPMT low activity variants, in eterozygosity, resulted in slight differences in intra-PBMC concentrations of these metabolites, denoting a moderate risk of developing toxic effects, as already known in literature. To explain some of the remaining open questions, prospective studies, including not tolerating patients will be needed, in order to have a correct pharmacokinetic comparison with tolerating patients and determining the right intra-PBMC therapeutic range. Moreover, in these future studies further genetic polymorphisms should be considered, on genes involved in the transport and metabolism of purinic nucleosides and nucleotides
Le malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) sono patologie si tipo autoimmune che spesso richiedono l'utilizzo di farmaci immunosoppressori, per mantenere la remissione dei sintomi. Gli immunosoppressori utilizzati nel trattamento sono i farmaci tiopurinici: 6-mercaptopurina (6-MP) e azatioprina (AZA,profarmaco della 6-MP). Studi precedenti indicano come l'insorgenza di eventi avversi e l'efficacia di tale trattamento siano relazionabili ad aspetti farmacocinetici e farmacogenetici. Per quanto riguarda la farmacocinetica, le concentrazioni dei metaboliti(6-TG)e(6-MMP) nei globuli rossi sono state correlate sia all'efficacia che alla tossicità del trattamento.Tuttavia, non esistevano evidenze circa le concentrazioni di questi metaboliti all'interno delle cellule target: i linfociti.Tra i fattori farmacogenetici il più importante è costituito dai polimorfismi del gene(TPMT)un enzima che metabolizza la 6-MP in 6-MMP. L'obiettivo principale di questo studio è stato quindi la validazione di un metodo bioanalitico atto a quantificare la 6-TGriboside (6TGr, attiva) e 6-MMPriboside (6-MMPr) ed i nucleotidi da esse derivati, all'interno dei PBMC: linfociti e monociti. Il secondo obiettivo è stato la valutazione delle concentrazioni di tali metaboliti su campioni provenienti da pazienti in terapia di mantenimento con AZA e dell'impatto dei principali polimorfismi a un singolo nucleotide (SNPs) del gene TPMT (TPMT*2,*3B,*3C,*3A) su queste concentrazioni. La quantificazione di 6-TGr e 6-MMPr in forma nucleosidica e nucleotidica è stata effettuata attraverso un protocollo di de-fosforilazione enzimatica, seguita da analisi con rilevatore Massa/Massa. L'isolamento dei PBMC è stato effettuato attraverso l'utilizzo di CPT vacuteiner. La genotipizzazione di ogni paziente è stata effettuata tramite tecniche di PCR e RFLP. Per quanto riguarda le analisi cinetiche, si è riscontrato come i 2 metaboliti esistano nella cellula come composti fosforilati (84% ca.). Lo studio genetico ha evidenziato che 41 pazienti su 43 presentano genotipo omozigote wild-type *1/ *1 e solo 2 presentano genotipo eterozigote *1/ *3A per la TPMT. I pazienti eterozigoti hanno un rapporto dei due metaboliti sbilanciato a favore della 6-TGr rispetto agli omozigoti; questa differenza, però, non risulta statisticamente significativa (p=0,291). L'unico dato significativo emerso è una concentrazione di 6-TGr totale inferiore (p=0,05) nel sesso femminile, senza differenze significative nelle concentrazioni di 6-MMPr. Le differenze nelle concentrazioni intracellulari potrebbero essere dovute alla maggiore penetrazione della 6-MP o minore attività della TPMT dei pazienti di sesso maschile. In conclusione, i risultati di questo studio suggeriscono l'esistenza di una variabilità nelle concentrazioni dei due principali metaboliti dell'AZA all'interno dei PBMC. La presenza di mutazioni del gene della TPMT, in eterozigosi, risulta in lievi differenze nelle concentrazioni dei due metaboliti all'interno dei PBMC, denotando un basso rischio di presentare concentrazioni tossiche, come peraltro già riportato in letteratura. Per far luce su questi quesiti ancora aperti risultano necessari ulteriori studi di tipo prospettico, che includano pazienti non tolleranti, allo scopo di valutare eventuali differenze nelle concentrazioni. Inoltre, sarà opportuno includere nell'analisi farmacogenetica polimorfismi di ulteriori geni coinvolti nel metabolismo delle basi e dei nucleosidi purinici
Farmacogenetica e farmacocinetica dei metaboliti intracellulari dell'azatioprina nel trattamento delle IBD.
NAMIO, ALESSANDRO
2014/2015
Abstract
Le malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) sono patologie si tipo autoimmune che spesso richiedono l'utilizzo di farmaci immunosoppressori, per mantenere la remissione dei sintomi. Gli immunosoppressori utilizzati nel trattamento sono i farmaci tiopurinici: 6-mercaptopurina (6-MP) e azatioprina (AZA,profarmaco della 6-MP). Studi precedenti indicano come l'insorgenza di eventi avversi e l'efficacia di tale trattamento siano relazionabili ad aspetti farmacocinetici e farmacogenetici. Per quanto riguarda la farmacocinetica, le concentrazioni dei metaboliti(6-TG)e(6-MMP) nei globuli rossi sono state correlate sia all'efficacia che alla tossicità del trattamento.Tuttavia, non esistevano evidenze circa le concentrazioni di questi metaboliti all'interno delle cellule target: i linfociti.Tra i fattori farmacogenetici il più importante è costituito dai polimorfismi del gene(TPMT)un enzima che metabolizza la 6-MP in 6-MMP. L'obiettivo principale di questo studio è stato quindi la validazione di un metodo bioanalitico atto a quantificare la 6-TGriboside (6TGr, attiva) e 6-MMPriboside (6-MMPr) ed i nucleotidi da esse derivati, all'interno dei PBMC: linfociti e monociti. Il secondo obiettivo è stato la valutazione delle concentrazioni di tali metaboliti su campioni provenienti da pazienti in terapia di mantenimento con AZA e dell'impatto dei principali polimorfismi a un singolo nucleotide (SNPs) del gene TPMT (TPMT*2,*3B,*3C,*3A) su queste concentrazioni. La quantificazione di 6-TGr e 6-MMPr in forma nucleosidica e nucleotidica è stata effettuata attraverso un protocollo di de-fosforilazione enzimatica, seguita da analisi con rilevatore Massa/Massa. L'isolamento dei PBMC è stato effettuato attraverso l'utilizzo di CPT vacuteiner. La genotipizzazione di ogni paziente è stata effettuata tramite tecniche di PCR e RFLP. Per quanto riguarda le analisi cinetiche, si è riscontrato come i 2 metaboliti esistano nella cellula come composti fosforilati (84% ca.). Lo studio genetico ha evidenziato che 41 pazienti su 43 presentano genotipo omozigote wild-type *1/ *1 e solo 2 presentano genotipo eterozigote *1/ *3A per la TPMT. I pazienti eterozigoti hanno un rapporto dei due metaboliti sbilanciato a favore della 6-TGr rispetto agli omozigoti; questa differenza, però, non risulta statisticamente significativa (p=0,291). L'unico dato significativo emerso è una concentrazione di 6-TGr totale inferiore (p=0,05) nel sesso femminile, senza differenze significative nelle concentrazioni di 6-MMPr. Le differenze nelle concentrazioni intracellulari potrebbero essere dovute alla maggiore penetrazione della 6-MP o minore attività della TPMT dei pazienti di sesso maschile. In conclusione, i risultati di questo studio suggeriscono l'esistenza di una variabilità nelle concentrazioni dei due principali metaboliti dell'AZA all'interno dei PBMC. La presenza di mutazioni del gene della TPMT, in eterozigosi, risulta in lievi differenze nelle concentrazioni dei due metaboliti all'interno dei PBMC, denotando un basso rischio di presentare concentrazioni tossiche, come peraltro già riportato in letteratura. Per far luce su questi quesiti ancora aperti risultano necessari ulteriori studi di tipo prospettico, che includano pazienti non tolleranti, allo scopo di valutare eventuali differenze nelle concentrazioni. Inoltre, sarà opportuno includere nell'analisi farmacogenetica polimorfismi di ulteriori geni coinvolti nel metabolismo delle basi e dei nucleosidi purinici| File | Dimensione | Formato | |
|---|---|---|---|
|
769789_tesifinita150325inpdf.pdf
non disponibili
Tipologia:
Altro materiale allegato
Dimensione
1.67 MB
Formato
Adobe PDF
|
1.67 MB | Adobe PDF |
I documenti in UNITESI sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
https://hdl.handle.net/20.500.14240/11037