Validazione intra- e inter- laboratorio di un saggio Single Base Extension per la stima dell'età da campioni di sangue

In Forensics, age estimation from unknown biological samples found during investigations can provide an important investigative lead to identify individuals that left traces. In this field, collecting the analysis of the DNA methylation pattern (DNAm), which changes with aging, is particularly important because it is very helpful to elaborate epigenetic clocks that chan be used to estimate the biological age. Because of the scarce amount of material available in Forensics, it is necessary to identify a small number of DNAm markers that can provide informative and effective methylation results. The aim of this study promoted by the scientific association Genetisti Forensi Italiani was to collectively evaluate a "smart" assay in the blood of five CpG sites which are variably methylated in correlation with aging, and that are already described in the literature. These CpG sites are located in the genes ELOVL2, FHL2, KLF14, MIR29B2C and TRIM59. All the eight laboratories involved in the study conducted the test for the estimation of DNAm on 24 blood samples from known-age-individuals by conversion with sodium bisulfite, Single Base Extension (SBE) and Capillary Electrophoresis (CE). The results obtained showed a good reproducibility of the proposed protocol within each participating laboratory: only 15% of the total variability in the estimation of the proportion between methylated and non-methylated DNA for CpG sites was due to intra-laboratory variability. Other way round, there was a strong inter-laboratory variability; one of the possible explanations of this result was linked to the different EC platforms used. Given the heterogeneity of the results obtained, prediction models have been developed for each laboratory using different approaches: multiple linear regression with and without cross-validation "Leave-One-Out", and "lasso" regression. Mean Absolute Deviation (MAD) for our laboratory was between 2.57 and 3.65 years, depending on the model applied. From residuals analysis, it was found that only one third of the observed variability in terms of deviation between age and estimated age seems due to differences in results between laboratories, while the remaining part was attributable to biological differences between individuals whose DNAm patterns were "slowed down" or "accelerated" with respect to real age; not all selected markers were actually relevant for age estimation; for example, the KLF14 marker showed a very low correlation for all laboratories, while TRIM59 was informative only for some laboratories. In conclusion, the study confirms the high correlation between DNAm and aging for ELOVL2 and FHL2 (positive) and MIR29B2C (negative). This pool of markers may therefore form a good basis for the development of a universal assay, which will however require an increase in the number of samples to develop the prediction model, in order to consider the numerous physiological and pathological variables that may affect the age-related DNAm levels.

In Medicina Legale, la determinazione dell’età da campioni biologici ignoti rinvenuti durante le fasi di indagine può fornire un importante spunto investigativo utile ad identificare i soggetti che abbiano lasciato tracce. In questo ambito, particolare interesse sta riscuotendo l’analisi del pattern di metilazione del DNA (DNAm), che si modifica con l’invecchiamento e che è molto utile per elaborare orologi epigenetici con cui stimare l’età biologica. Poiché in ambito forense la quantità di materiale disponibile è spesso esigua, è necessario individuare un numero ristretto di marcatori DNAm in grado di fornire risultati di metilazione informativi e affidabili. Obiettivo di questo studio, promosso dall’associazione scientifica Genetisti Forensi Italiani, è stato quello di valutare collettivamente un saggio “minimo” comprendente cinque siti CpG variabilmente metilati in correlazione all’età nel sangue, già descritti in letteratura e situati in corrispondenza dei geni ELOVL2, FHL2, KLF14, MIR29B2C e TRIM59. Nello studio sono stati coinvolti otto Laboratori, ognuno dei quali ha condotto il saggio per la stima di DNAm su un totale di 24 campioni di sangue donati da soggetti di età nota mediante conversione con bisolfito di sodio, Single Base Extension (SBE) ed Elettroforesi Capillare (CE). I risultati ottenuti hanno evidenziato una buona riproducibilità del protocollo proposto all’interno dei singoli Laboratori partecipanti: solo il 15% della variabilità totale nella stima della proporzione tra DNA metilato e non metilato per i siti CpG risultava dovuta a variabilità intra-laboratorio. Vi era viceversa una forte variabilità inter-laboratorio; una tra le possibili spiegazioni di questo risultato è risultata connessa alle differenti piattaforme CE impiegate. Stante l’eterogeneità dei risultati ottenuti, sono stati elaborati modelli di predizione per i singoli Laboratori impiegando diversi approcci: regressione lineare multipla con e senza cross-validation “Leave-One-Out”, e regressione “lasso”. Lo scostamento medio tra stima dell’età ed età reale del campione analizzato (Mean Absolute Deviation, MAD), per il nostro Laboratorio è risultata compresa tra 2,57 e 3,65 anni, a seconda del modello applicato. Dall’analisi è inoltre emerso che: solo un terzo della variabilità osservata in termini di scostamento tra età anagrafica e stimata appariva dovuta a differenze di risultati tra laboratori, mentre la restante parte era attribuibile a differenze biologiche tra individui i cui pattern di DNAm erano “rallentati” o “accelerati” rispetto all’età reale; non tutti i marcatori selezionati erano effettivamente rilevanti per la stima dell’età; ad esempio il marcatore KLF14 ha mostrato una correlazione molto bassa per tutti i Laboratori, mentre TRIM59 risultava informativo solo per alcuni Laboratori. In conclusione, lo studio conferma l’alta correlazione tra DNAm e invecchiamento per ELOVL2 e FHL2 (positiva) e MIR29B2C (negativa). Questo sottoinsieme di marcatori potrà pertanto costituire una buona base per lo sviluppo di un saggio universale, che richiederà tuttavia l’incremento del numero di campioni per sviluppare il modello di predizione, in modo da tenere conto delle numerose variabili fisio-patologiche che possono avere un impatto sui livelli di DNAm in relazione all’età.