Intentional or accidental poisoning of domestic animals remains a current issue and is a matter of public health. In fact, the use of poisoned baits puts at risk human, animals, and environment well-being, and it’s liable to be persecuted. However, currently the use of poisoned baits is allowed to control rats’ infestations, which are carriers of many diseases and increases the proliferation of pathogens. The concern relates to the widespread use of anticoagulants rodenticides (ARs) as rat poisons and their dispersion into the environment. Consequence of that is the poisoning of non-target animals. Moreover, the easy availability of these compounds enables their use by malicious people and that represents a problem of public safety. This thesis project was carried out at the laboratories of the Zooprophylactic and Experimental Institute of the Venezie (PD). The aim of this project is the optimization of an analytical and multiresidue method for the determination of ARs in matrices like whole blood, plasma and serum of dogs and cats, in suspected cases of intentional or accidental poisoning. Over the years, the IZSVe developed a multianalytical method LC-HRMS for the determination of ARs, that is currently used for routine analysis of baits and livers of dead animals with poisoning symptoms. This method doesn’t allow to save the animals because liver sampling is done by a vet only after the animal death. Therefore, the optimization of a new method is necessary. This new method includes a simple and fast extraction with QuEChERs salts from whole blood, plasma and serum of dogs and cats.The instrumental set-up is composed of UHPLC coupled to a mass spectrometer with Orbitrap Q-Exactive analyzer that works in PRM (parallel reaction monitoring) mode. The method was fully validated in agreement with the guidelines laid down by Sante/11312/2021.The method resulted good linearity (R2 0,98) for all compounds and all the matrices in the intervals of concentrations (50 ng/mL – 400 ng/mL) and (400 ng/mL – 1600 ng/mL). The recovery was between 70% and 120%, except for some ARs which was between 30-140%. For all the compounds and for all the matrices repeatability (CV%) was 20%. Furthermore, specificity was verified and matrix effect was absent. Consequently, thanks to this new method for animal whole blood, plasma and serum, a quicker diagnosis will be possible in case of suspected poisoning and there will be a chance to save the animal.
I casi di avvelenamento, accidentale o intenzionale, di animali d’affezione sono una tematica che continua ad essere attuale e costituisce anche un problema di salute pubblica. Infatti, l’uso di esche e bocconi contenenti sostanze velenose mette in grave rischio il benessere dell’uomo, degli animali e dell’ambiente ed è una pratica penalmente perseguibile. Tuttavia, ad oggi è permesso l’utilizzo di esche avvelenate per il controllo antropogenico delle infestazioni causate dai topi, i quali sono portatori di numerose malattie ed aumentano il rischio di proliferazione di patogeni. La preoccupazione che concerne l’utilizzo ormai diffuso degli anticoagulanti rodenticidi (ARs), come topicidi e la loro dispersione nell’ambiente, riguarda l’effetto non mirato e circoscritto di queste sostanze all’animale bersaglio, ossia il topo. La facile reperibilità, inoltre, fa sì che gli ARs possano essere deliberatamente impiegati in esche e bocconi avvelenati a scopo doloso, rappresentando un ulteriore problema di sanità e incolumità pubblica. Lo scopo di questo progetto di tesi svolto presso i laboratori della Struttura Complessa SCS-2 Chimica dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe) di Legnaro (PD), nasce dalla necessità di mettere a punto un metodo analitico multiresiduale per la determinazione di anticoagulanti rodenticidi (ARs) in matrici quali sangue, siero e plasma di cani e gatti in sospetti casi di avvelenamento accidentale o doloso. Negli anni, l’IZSVe ha sviluppato un metodo multianalita in cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa ad alta risoluzione per la determinazione degli ARs che viene tutt’ora utilizzato nelle analisi di routine di esche, bocconi sospetti e fegati di animali deceduti con presunti sintomi di avvelenamento da ARs. Ciò non permette di avere alcuna probabilità di salvare l’animale dall’avvelenamento, nonostante venga stabilito l’ARs assunto, in quanto il prelievo del fegato da parte del veterinario specializzato avviene solamente quando l’animale è già deceduto. Per questo è stata necessaria l’ottimizzazione di un nuovo metodo con una procedura di estrazione semplice e veloce a partire da sangue intero, plasma e siero di cani e gatti che implica l’utilizzo dei sali di QuEChERs. L’assetto strumentale è costituito da un UHPLC collegato ad uno spettrometro di massa con analizzatore Orbitrap Q-Exactive che lavora in modalità PRM (parallel reaction monitoring). In sede di validazione seguendo il Documento Sante/11312/2021, il metodo ha presentato linearità per tutti i composti e per tutte le matrici (R2 0,98) negli intervalli (50 ng/mL – 400 ng/mL) e (400ng/mL – 1600 ng/mL) di concentrazione su campione. Il recupero della maggior parte degli anticoagulanti studiati rientra nel range 70-120%, tranne per alcuni che ricadono nell’intervallo 30-140%. Tutti i composti per tutte le matrici presentano un CV 20%. Inoltre, è stata verificata la specificità e non è stato riscontrato alcun effetto matrice. Pertanto, grazie al set-up di questo nuovo metodo ottimizzato per campioni di sangue, siero e plasma animale come matrici di partenza, sarà possibile una diagnosi più rapida in situazioni di sospetto avvelenamento e soprattutto ci sarà la possibilità di salvare l’animale, una volta comprovata o meno l’ingestione di ARs
Ottimizzazione e validazione di un metodo per la determinazione di anticoagulanti rodenticidi in sangue animale tramite UHPLC-MS/MS
SAMMARTINARO, CINZIA
2022/2023
Abstract
I casi di avvelenamento, accidentale o intenzionale, di animali d’affezione sono una tematica che continua ad essere attuale e costituisce anche un problema di salute pubblica. Infatti, l’uso di esche e bocconi contenenti sostanze velenose mette in grave rischio il benessere dell’uomo, degli animali e dell’ambiente ed è una pratica penalmente perseguibile. Tuttavia, ad oggi è permesso l’utilizzo di esche avvelenate per il controllo antropogenico delle infestazioni causate dai topi, i quali sono portatori di numerose malattie ed aumentano il rischio di proliferazione di patogeni. La preoccupazione che concerne l’utilizzo ormai diffuso degli anticoagulanti rodenticidi (ARs), come topicidi e la loro dispersione nell’ambiente, riguarda l’effetto non mirato e circoscritto di queste sostanze all’animale bersaglio, ossia il topo. La facile reperibilità, inoltre, fa sì che gli ARs possano essere deliberatamente impiegati in esche e bocconi avvelenati a scopo doloso, rappresentando un ulteriore problema di sanità e incolumità pubblica. Lo scopo di questo progetto di tesi svolto presso i laboratori della Struttura Complessa SCS-2 Chimica dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe) di Legnaro (PD), nasce dalla necessità di mettere a punto un metodo analitico multiresiduale per la determinazione di anticoagulanti rodenticidi (ARs) in matrici quali sangue, siero e plasma di cani e gatti in sospetti casi di avvelenamento accidentale o doloso. Negli anni, l’IZSVe ha sviluppato un metodo multianalita in cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa ad alta risoluzione per la determinazione degli ARs che viene tutt’ora utilizzato nelle analisi di routine di esche, bocconi sospetti e fegati di animali deceduti con presunti sintomi di avvelenamento da ARs. Ciò non permette di avere alcuna probabilità di salvare l’animale dall’avvelenamento, nonostante venga stabilito l’ARs assunto, in quanto il prelievo del fegato da parte del veterinario specializzato avviene solamente quando l’animale è già deceduto. Per questo è stata necessaria l’ottimizzazione di un nuovo metodo con una procedura di estrazione semplice e veloce a partire da sangue intero, plasma e siero di cani e gatti che implica l’utilizzo dei sali di QuEChERs. L’assetto strumentale è costituito da un UHPLC collegato ad uno spettrometro di massa con analizzatore Orbitrap Q-Exactive che lavora in modalità PRM (parallel reaction monitoring). In sede di validazione seguendo il Documento Sante/11312/2021, il metodo ha presentato linearità per tutti i composti e per tutte le matrici (R2 0,98) negli intervalli (50 ng/mL – 400 ng/mL) e (400ng/mL – 1600 ng/mL) di concentrazione su campione. Il recupero della maggior parte degli anticoagulanti studiati rientra nel range 70-120%, tranne per alcuni che ricadono nell’intervallo 30-140%. Tutti i composti per tutte le matrici presentano un CV 20%. Inoltre, è stata verificata la specificità e non è stato riscontrato alcun effetto matrice. Pertanto, grazie al set-up di questo nuovo metodo ottimizzato per campioni di sangue, siero e plasma animale come matrici di partenza, sarà possibile una diagnosi più rapida in situazioni di sospetto avvelenamento e soprattutto ci sarà la possibilità di salvare l’animale, una volta comprovata o meno l’ingestione di ARsI documenti in UNITESI sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
https://hdl.handle.net/20.500.14240/107720