circRNAs represents a fascinating class of RNA molecules which originates from a form of alternative splicing called backsplicing. As long considered as byproducts of splicing mechanism, circRNA have been shown to be implicated in numerous cellular processes in both physiological and pathological state. Among them, circFARSA, derived from circularization of FARSA gene, seems to be upregulated in different conditions, such as Non Small Cell Lung Cancer. The aim of this work is to investigate the role of circFARSA in Non Small Cell Lung Cancer migration and invasive properties. As a model, we selected three NSCLC cell lines: one adenocarcinoma (A549), one squamous carcinoma (NCI-H520), and one lymph node derived-metastatic cell line (NCI-H2030), all compared with a healthy bronchial-epithelium cell line (16HBE14o-). By qRT-PCR, we observed that circFARSA was differentially expressed among NSCLC cell lines and healthy control. Subsequently, to investigate the biological role of circFARSA in these cells, we design a specific circFARSA-siRNA recognizing the backsplicing junction. CircFARSA-silenced cells were essayed in viability and migration tests and it was observed that viability and migration was significantly impaired following circFARSA silencing. Then, focusing on circFARSA protein-sponge functions, we predicted, with bioinformatic tools, IGF2BP3 as the best potential circFARSA RBP and validated in vitro their interaction through RNA immunoprecipitation and RNA pull down experiments. These results suggest a potential role of biological interactions between corcFARSA and IGF2BP3 in NSCLC proliferation, progression and metastasis.
Gli RNA circolari rappresentano una classe di molecole endogene di RNA, la cui sintesi deriva da un processo di splicing alternativo detto backsplicing. A lungo considerati prodotti secondari del meccanismo di splicing, gli RNA circolari sono oggi noti per il loro ruolo biologico in numerosi processi cellulari, in condizioni patologiche e fisiologiche. Le funzioni principali dei circRNA sono la regolazione del meccanismo molecolare attraverso il cosiddetto miRNA-sponging e l’interazione con proteine che legano l'RNA (RBPs). All'interno di questo gruppo, circFARSA, derivante dalla circolarizzazione del gene FARSA, risulta essere deregolato in numerose condizioni, come il carcinoma polmonare Non a Piccole Cellule (NSCLC). L'obiettivo di questo lavoro di ricerca è quello di caratterizzare il ruolo biologico di circFARSA nella migrazione del NSCLC. Come modello sono state selezionate 4 differenti linee cellulari: carcinoma squamocellulare (NCI-h520), cellule derivanti da metastasi linfonodali e adenocarcinoma polmonare (A549). Per studiare le funzioni di miRNA sponging di circFARSA, la proteina oncofetale IGF2BP3 è stata predetta dal punto di vista bioinformatico come potenziale RBP, con un punteggio di 0.98. Una volta studiata l’espressione di IGF2BP3 nelle linee cellulari di carcinoma polmonare non a piccole cellule, mediante RT-qPCR, è stata validata in vitro l’interazione di circFARSA e IGF2BP3 mediante esperimenti di immunoprecipitazione dell’RNA e RNA pull-down. Successivamente, per investigare il ruolo di circFARSA nella migrazione del NSCLC, mediante l’uso di un siRNA che legasse in modo specifico la giunzione di backsplicing, sulle linee cellulari silenziate per circFARSA è stato eseguito un saggio di migrazione, da cui è emersa una significativa riduzione della migrazione. Questi risultati confermano il ruolo biologico di circFARSA nella migrazione e nella proliferazione del carcinoma polmonare non a piccole cellule.
Caratterizzazione del complesso circFARSA?IGF2BP3 in linee cellulari di carcinoma polmonare non a piccole cellule
COMPARATO, SIMONA
2022/2023
Abstract
Gli RNA circolari rappresentano una classe di molecole endogene di RNA, la cui sintesi deriva da un processo di splicing alternativo detto backsplicing. A lungo considerati prodotti secondari del meccanismo di splicing, gli RNA circolari sono oggi noti per il loro ruolo biologico in numerosi processi cellulari, in condizioni patologiche e fisiologiche. Le funzioni principali dei circRNA sono la regolazione del meccanismo molecolare attraverso il cosiddetto miRNA-sponging e l’interazione con proteine che legano l'RNA (RBPs). All'interno di questo gruppo, circFARSA, derivante dalla circolarizzazione del gene FARSA, risulta essere deregolato in numerose condizioni, come il carcinoma polmonare Non a Piccole Cellule (NSCLC). L'obiettivo di questo lavoro di ricerca è quello di caratterizzare il ruolo biologico di circFARSA nella migrazione del NSCLC. Come modello sono state selezionate 4 differenti linee cellulari: carcinoma squamocellulare (NCI-h520), cellule derivanti da metastasi linfonodali e adenocarcinoma polmonare (A549). Per studiare le funzioni di miRNA sponging di circFARSA, la proteina oncofetale IGF2BP3 è stata predetta dal punto di vista bioinformatico come potenziale RBP, con un punteggio di 0.98. Una volta studiata l’espressione di IGF2BP3 nelle linee cellulari di carcinoma polmonare non a piccole cellule, mediante RT-qPCR, è stata validata in vitro l’interazione di circFARSA e IGF2BP3 mediante esperimenti di immunoprecipitazione dell’RNA e RNA pull-down. Successivamente, per investigare il ruolo di circFARSA nella migrazione del NSCLC, mediante l’uso di un siRNA che legasse in modo specifico la giunzione di backsplicing, sulle linee cellulari silenziate per circFARSA è stato eseguito un saggio di migrazione, da cui è emersa una significativa riduzione della migrazione. Questi risultati confermano il ruolo biologico di circFARSA nella migrazione e nella proliferazione del carcinoma polmonare non a piccole cellule. | File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.14240/107501