Attacco Covalente di Polimeri a Stampo Molecolare sulla Superficie di Nanoparticelle d'Oro Modificate con Silice

I polimeri a stampo molecolare (MIP) sono strutture polimeriche reticolate che presentano siti selettivi per il riconoscimento molecolare, e possono quindi essere descritti come gli analoghi sintetici dei leganti naturali (quali anticorpi). Di conseguenza, vi è una forte propensione da parte della comunità scientifica nell’applicazione di questi polimeri in test immunodiagnostici, in quanto anticorpi e MIP, al di là delle differenze strutturali, mostrano proprietà di legame e di equilibrio di formazione del complesso recettore-ligando simili. In aggiunta, i MIP offrono una maggiore resistenza all’ambiente circostante, un costo contenuto di produzione, e la risoluzione del problema etico dell’utilizzo di animali previsto per l’ottenimento dei bioreagenti anticorpali. Il lavoro svolto si è quindi posto l’obiettivo di impiegare MIP, e, in particolare, in forma nanometrica (nanoMIP) come possibili sostituti di anticorpi in una piattaforma analitica basata sull’impiego di questi ultimi denominata Lateral Flow ImmunoAssay (LFIA). A tale fine, il nanoMIP necessita di essere coniugato a particelle colorate (nel presente lavoro si sono utilizzate nanoparticelle di oro metallico, AuNPs comunemente utilizzate in test tipo LFIA). Nella prima fase si è studiata la preparazione di nanoparticelle core-shell Au-Si e la loro funzionalizzazione con residui amminici, sfruttati poi nella creazione di un legame ammidico con il nanoMIP. Sono stati studiati due approcci: uno Two-Steps, in cui le fasi di silanizzazione e amminazione sono temporalmente separate, e uno One-Step in cui la creazione dello shell di silice e la funzionalizzazione con gruppi amminici avvengono contemporaneamente. L’ottimizzazione ha portato ad un protocollo One-Step da cui sono state ottenute nanoparticelle le cui caratteristiche strutturali rientrano nell’intervallo delle nanodimensioni, nonché caratteristiche chimico-fisiche quali la risonanza plasmonica di superficie con un picco di buona intensità a 538 nm, resistenza all’aggregazione, buona capacità di flusso su membrana porosa, riproducibilità e stabilità. La seconda fase si è concentrata sull’ottimizzazione delle condizioni di coniugazione, lavaggio e conservazione del coniugato particella-nanoMIP. Il parametro che più si è mostrato influente sulla resa è stato il numero di lavaggi subiti dal prodotto: è stato infatti verificato che, con l’eliminazione di un passaggio di lavaggio (mediante centrifugazione e risospensione), la percentuale di perdita di coniugato è diminuita dal 52% al 10%. Infine, è stata valutata l’effettiva applicabilità di tale coniugato in test immunodiagnostici di tipo LFIA, confermando che il nanoMIP mantiene le caratteristiche di legame specifico verso la molecola stampo e, allo stesso tempo, la presenza delle AuNP consente la rivelazione visiva degli eventi di legame. In conclusione, si è dimostrato che i protocolli messi a punto permettono di ottenere coniugati dei nanoMIP che possono essere impiegati come alternative agli anticorpi in test LFIA.